煮沸裂解法制备质粒DNA实验
实验方法原理 经 Triton X-100、溶菌酶和加热处理可从小量（1~2 ml ) 细菌培养物中分离质粒 DNA 所获得的质粒则可以用电泳或限制性内切核酸酶消化的方法鉴定；经 PEG 处理进一步纯化后，其可以用做 DNA 测序反应的模板。
试剂、试剂盒 抗生素乙醇异丙醇乙酸钠STETTE溶菌酶
仪器、耗材 LB、YT 或 Terrific 培养液沸水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液及溶液
(1) 用于质粒筛选的抗生素
(2) 乙醇
(3) 异丙醇
(4) 乙酸钠（3.0 mol/L，pH 5.2）
(5) STET
(6) TE（pH 8.0），含 20 μg/ml 的 RNase A
2. 酶和缓冲液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml）
3. 培养基
(1) LB、YT 或 Terrific 培养液
4. 专用设备
(1) 沸水浴
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑取转化细菌的单菌落，接种到 2 ml 含适当抗生素的培养液（LB、YT 或 Terrific 培养液）中，于 37℃ 剧烈振摇，培养过夜。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养物应在剧烈振摇下培养。
(2) 将 1.5 ml 培养液倒入微量离心管中，于 4℃ 下以最大速度离心 30 s。将未离心的培养液在 4℃ 储存。
(3) 离心结束，尽可能吸干培养液。
除去上清的简便方法是用一次性吸头或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连。轻微抽吸，并使吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，以尽量避免沉淀被吸到侧臂烧瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液，并用吸头除去管壁上附着的液滴。
未从细苗沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切割或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种内切酶的活性。
(4) 用 350 μl STET 重悬细菌沉淀。
确保细菌迅速完全地重悬于 STET。将两个离心管的底部接触同时振荡，重悬效果更好。
2. 细胞的裂解
(1) 加 25 μl 新配制的溶菌酶溶液。盖上离心管盖，轻微涡旋混合 3 s。
(2) 将离心管于沸水浴中精确放置 40 s。
延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性（Vinograd and Lebowitz 1996），所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA。
(3) 在室温下用微量离心机以最大速度离心细菌裂解液 15 min。将上清倒入洁净离心管中。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 在上清中加入 40 μl 2.5 mol/L 的乙酸钠（pH 5.2）和 420 μl 异丙醇以沉淀核酸。振荡混匀溶液，并在室温下放置 5 min。
(2) 在 4℃ 用微量离心机以最大速度离心 10 min，回收沉淀的核酸。
在离心机中放置离心管时，最好养成总是用同一种方式放置的习惯。例如，按一定顺序将离心管的塑料柄朝外，这样沉淀总是聚集在离转头中心最远的离心管内壁。知道 DNA 沉淀在什么地方，可以较容易地找到可见的沉淀，也就能有效地溶解看不见的沉淀。
当从大肠杆菌的 endA+ 菌株中提取质粒时，应该用苯酚：氯仿抽提，简单步骤如下：用 100 μl TE （pH 8.0）重悬异丙醇沉淀下来的 DNA；加入 100 μl 苯酚：氯仿（1:1，V/V），涡旋混匀 15~30 s；室温下以最大速度离心 2 min，分离水相和有机相；将水相转移到新离心管中，加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）和 2.5 倍体积乙醇，以最大速度离心 10 min 回收核酸，后续处理接下面。
(3) 按步骤 3 所述除去上清，在纸巾上倒置离心管使所有液体流尽。用 Kimwipe 或一次性吸头除去黏附在管壁上的液滴。
通常在离心管底部的管壁可以看到乳状核酸沉淀。
(4) 于 4℃ 用 1 ml 70% 乙醇漂洗核酸沉淀，再按步骤 3 中的方法除去所有上清。
这一步要特别小心，因为有时候沉淀并不紧贴管壁。
(5) 除去管壁上所有的乙醇液滴。敞开管口放置在室温下，直到乙醇全部挥发，管壁上看不到液滴（2~5 min）为止。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987）。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(6) 用 50 μl 含 RNase A（胰 RNA 酶，无 DNase ) 的 TE ( pH 8.0）溶解核酸，轻轻地涡旋混匀，置 -20℃ 保存。
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