芥菜型油菜种皮转录组De Novo拼接及类黄酮生物合成基因
芥菜型油菜作为一种广泛种植的作物，能产生不同颜色的种子。种子的着色是由于内皮细胞原花色素（proanthocyanidins，PA）的沉积，该终产物是通过一条类黄酮化合物合成的途径形成。为了进一步了解芥菜型油菜种子着色的基因信号网络，研究者采用Illumina/Solexa测序平台检测近交系黄籽种皮（SY）以及近等位基因系棕籽种皮（NILA）的转录组基因，对检测结果进行De Novo拼接，超过1.16亿个高质量的reads被组装成69,605个独立基因，其中以E value值为10-5为截点，大约71.5%（49,758个独立基因）能比对到Nr蛋白数据库。RPKM分析结果显示，棕籽种皮较黄籽种皮，有802个基因上调，502个基因下调。生物学通路分析显示，46个基因与类黄酮合成相关。在黄籽中，与后期类黄酮生物合成相关的编码基因二氢黄酮还原酶(DFR)、白花色素双加氧酶(LDOX)、花色素还原酶(ANR)不表达或者表达水平非常低，这也暗示了这些与PA合成相关的基因可能与芥菜型油菜种皮的着色相关，qRT-PCR检测进一步确认了该结果。
本研究是湖南农业大学油料作物研究所刘忠松教授课题组完成的。该研究首次实现芥菜型油菜种皮转录组测序，研究中所获得的基因不仅有利于阐明荠菜型油菜种皮着色的分子机制，且为该物种今后的基因组学研究提供了基础。研究中所涉及的Illumina HiSeq 2000测序服务以及数据分析服务由上海伯豪生物技术有限公司提供。
转录组测序及De Novo拼接：对SY以及NILA的转录组进行测序，在去除接头序列、低质量的序列等后，得到高质量的reads，结果见下表：
Figure 2 Overview of the Brassica juncea seed coat transcriptome assembly. (A) The size distribution of the scaffolds； (B) The size distribution of unigenes.
采用CLC Genomic Workbench 4.9软件，将高质量的reads进行拼接，获得99,096个contig，且每个contig的最小长度为200bp，通过pair-end连接以及缝隙拼接，产生了79,520个scaffold，平均每个scaffold长度为200bp。Figure 2A为scaffold分布图。采用CD-HIT (V.4.5.4)软件将scaffold进一步组装成69,605个独立基因，其分布图见Figure 2B。具体参数见表格。
功能注释：功能基因与NCBI的non redundant (Nr)蛋白数据库进行blast比对（以E value值10-5为截点），大约71.5%（49,758个独立基因）能比对到该数据库，它们中62.01%的基因E-value值低于1E-50且具有很好的同源性，剩余的37.99%的基因E-value值在1E-5与1E-50之间，见Figure 3A。相似度分析显示在能比对到Nr数据库的基因中50.06%的基因相似度超过90%，46.21%的基因相似度在60%-90%之间，仅仅有3.72%的基因相似度低于60%，见Figure 3B。种群分布图显示在能比对到Nr数据库的基因中接近96.49%的基因与6种热门物种相匹配：琴叶拟南芥(46.59%)，鼠耳芥(40.59%)，盐芥(3.37%)，另外三种均属于十字花科，种群分布图中前20种的名称见Figure 3C。
Figure 3. Characteristics of homology search of Brassica juncea seed coat unigenes. (A) E-value distribution of the top Blastx hits against the non-redundant (Nr) protein database for each unigene； (B) Similarity distribution of the best Blastx hits for each unigene； (C) Number of unigenes matching the 20 top species using Blastx in the Nr database.
Figure 4. GO classification of unigenes of B.juncea seed coat.
GO分类：依据序列的同源性进行GO分类，结果显示，在所有拼接出的基因中有19,618个基因可被归为37个功能组，其中最主要的三类（生物过程、细胞组成、分子功能）可以比分别比对到31,026, 22,918 以及 26,267个GO分类组，详见Figure 4。
COG分类：将49,758个能比对到 Nr蛋白数据库的基因进行COG分类，结果显示25,140个基因聚成25种功能组。其中最大的COG分类组为信号转导机制组（10,471个基因大约占41.6%），详见Figure 5。
Figure 5. COG function classification of transcriptome.
KEGG分类：通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析69,605个基因，显示14,998个基因能比对到258条信号通路。最主要的信号通路为代谢通路（3,506个基因，大约占23.37%），其次为次生代谢物的合成 (1,785,11.9%)，不同环境中微生物的代谢（802，5.35%)，RNA降解（538, 3.59%）以及核糖体(535, 3.57%)。研究者将目光聚焦到了与荠菜型油菜种皮着色相关的次生代谢物合成通路，发现154个基因与苯丙素生物合成相关，114个基因与苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成相关，46个基因与类黄酮生物合成相关，9个基因与黄酮以及黄酮醇生物合成相关。
种皮转绿组中转录因子的鉴定：将所有拼接得到的基因通过Blastx比对到AGRIS (Arabidopsis Gene Regulatory Information Server)数据库，E-value值小于10-5，identity大于70%，2,347个基因被推定属于48个转录因子家族，其中MYB（100个基因）以及bHLH（190个基因）两个家族在植物中与类黄酮生物合成相关。
黄色与棕色种皮中不同表达的转录本:为了观察两种不同颜色的种皮中基因的表达水平，通过RPKM分析它们各自被拼接出的69,605个基因。其中1,304个基因在两者中的表达水平有差异，棕色种皮与黄色种皮相比较，有802个基因上调，502个基因下调，在这些基因中，170 (12.8%)个基因表达水平有15倍的差异，471 (36.4%)个有2-3倍的差异，详见Figure 6。对差异表达的基因进行注释发现455个基因属于28个GO组，849个基因不能进行归类，详见Figure 7。
Figure 6. The fold change distribution of differentially expressed between the yellow -and brown-seeded testa of Brassica juncea.
Figure 7. Functional categoried of unigenes differentially expressed between the yellow -and brown-seeded testa of Brassica juncea.
与类黄酮生物合成信号通路相关的种皮转绿组基因：在拟南芥中，PA的合成显示种子内皮细胞在授粉后3天（days after pollination，DAP)会有其生物合成基因的表达。在芥菜型油菜种皮中10 DAP才会出现PA的积累，芯片结果显示在埃塞俄比亚芥棕籽形成时， 22 DAP（形成角果）时，6个类黄酮基因（CHS、F3H、FOMT、DFR、GST以及TTG1）发生上调，2个基因（F39H、FLS）发生下调，该现象在黄籽形成时未发现。将次生壁丰富的甘蓝型油菜种皮及其下胚轴进行对比发现，类黄酮生物合成转录本的基因：ANR、FLS 以及 CHS在种皮中的含量更为丰富，这就意味着类黄酮生物合成基因在种皮中高表达，与PA在种皮中的沉积相一致。
Figure 8呈现了芥菜型油菜与类黄酮生物合成相关基因的表达情况。过去的研究表明DFR, LDOX 及ANR基因与PA合成相关，且DFR与LDOX基因在黄籽的芸苔属植物中不表达，本研究发现，DFR, ANR基因在黄籽中几乎不表达，在棕籽中高表达，LDOX在棕籽中的表达量也高于黄籽，结果表明，与PA合成相关的基因不表达或者低表达导致了黄籽的芥菜型油菜中没有PA的积累。
Figure 8. Unigenes involved in the flavonoid biosynthesis pathway in seed coat of Brassica juncea. Abbreviation: ANR, anthocyanidin reductase； CHS, chalcone synthase； CHI, chalcone isomerase； DFR, dihydroflavonol 4-reductase； F3H, flavanone 3-hydroxylase； F39H, flavonoid 39-hydroxylase； FLS, flavonol synthase； LDOX, leucoanthocyanidin dioxygenase.
类黄酮生物合成通路中基因的RT-PCR分析：为了对RPKM的分析结果进一步确证，选取了类黄酮生物合成过程中的8个基因（Figure 9）进行qRT-PCR分析，发现在棕色种皮中Unigene_920 (CHS), Unigene_29246 (CHI), Unigene_7597 (DFR), Unigene_7701 (LDOX), Unigene_16036(ANR)发生上调，Unigene_28310 (FLS)下调，Unigene_682 (F3H) 及Unigene_396 (F39H)未发生明显变化。该结果与RPKM分析结果相一致。
Figure 9. qRT-PCR validation of RPKM analysis of the eight unigenes involved in flavonoid biosynthesis of Brassica juncea seed coat.
原文出处：De Novo Transcriptome of Brassica juncea Seed Coat and Identification of Genes for the Biosynthesis of Flavonoids
Abstract：Brassica juncea, a worldwide cultivated crop plant, produces seeds of different colors. Seed pigmentation is due to the deposition in endothelial cells of proanthocyanidins (PAs), end products from a branch of flavonoid biosynthetic pathway.
To elucidate the gene regulatory network of seed pigmentation in B. juncea, transcriptomes in seed coat of a yellow-seeded inbred line and its brown-seeded near -isogenic line were sequenced using the next-generation sequencing platform
Illumina/Solexa and de novo assembled. Over 116 million high-quality reads were assembled into 69,605 unigenes, of which about 71.5% (49,758 unigenes) were aligned to Nr protein database with a cut-off E-value of 1025. RPKM analysis showed
that the brown-seeded testa up-regulated 802 unigenes and down-regulated 502 unigenes as compared to the yellow seeded one. Biological pathway analysis revealed the involvement of forty six unigenes in flavonoid biosynthesis. The unigenes encoding dihydroflavonol reductase (DFR), leucoantho-cyanidin dioxygenase (LDOX) and anthocyanidin reductase (ANR) for late flavonoid biosynthesis were not expressed at all or at a very low level in the yellow-seeded testa, which implied that these genes for PAs biosynthesis be associated with seed color of B. juncea, as confirmed by qRT-PCR analysis of these genes. To our knowledge, it is the first time to sequence the transcriptome of seed coat in Brassica juncea. The unigene sequences obtained in this study will not only lay the foundations for insight into the molecular mechanisms
underlying seed pigmentation in B.juncea, but also provide the basis for further genomics research on this species or its allies.
来源：上海伯豪生物技术有限公司
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