基因扩增技术de条件及影响因素
模板核酸
PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增,处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当,未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。
引物
PCR结果的特异性取决于引物的特异性,扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此,引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”,其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此,PCR所用引物质量要高,且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月,液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。
PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果,当PCR引物量太低,则产物量降低,会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶,dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜,但我们实验发现,最适浓度远远低于此浓度。
缓冲液
PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液,20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为-0.021/℃。因此,20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L,pH8.9,有时会增加产量。
反应混合液中50mmol/L以内的KCl,pH8.9有利于引物的退火,50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+,其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01%)或Tween 20(0.05% ～0.1%)有助于酶的稳定,反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用,尤其在扩增长片段(此时延伸时间长)时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。
Mg2+
Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性,这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火,模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性,引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力显著降低;过高时,通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板,引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合,降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。
三磷酸脱氧核苷酸
四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料,PCR反应中dNTP含量太低,PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入(即所谓的“热力背信”),因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。
耐热DNA聚合酶
PCR之所以能得到广泛应用,主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶,使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序,也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高(79℃),使引物在高温下进行退火和延伸,这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中,每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳,酶的浓度太低会使扩增产物产量降低,如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。
温度循环参数
1.变性温度与时间
PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开,才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高,时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性,所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要,需时间较长,因模板DNA的链比较长。
2.复性温度与时间
变性温度是PCR反应成败的关键,复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好,但是容易出现引物与靶DNA的错配,增加非特异性结合,温度太高不利于复性,大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。
3.延伸温度与时间
引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性,又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,也会影响其产量,72℃时,核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而,延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增,延伸时间要长些。
4.循环数:
循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下,最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外,酶活性不好,或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。
标本制备
编辑 语音
在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应,并使之达到自动化之后,PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单,而且,许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用,因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外,处理标本可使待扩增DNA暴露,能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多,我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染,且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃,10min,离心取上清作为PCR模板即可。
