细胞凋亡的检测方法综述-4
DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT）
切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。
将切片组织浸入2×SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲尽。
0.5%胃蛋白酶（pH2.0）37℃消化0～20min，PBS洗尽。
用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A，5min。缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgCl2， 10mmol/L β-巯基乙醇，0.005％BSA，pH7.5。
弃去缓冲液A，滴加标记液约50μl，25℃温育1h。标记反应液：0.005mmol/L dNTP， 0.005mol/L biotin-16-dUTP， 25U/ml Klenow大片段。
PBS漂洗2次，各3min。
内源酶阻断剂阻断15min。
PBS洗2次，各3min。
滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30min。
PBS洗2次，各3min。
DAB-H2O2显色约5min。
流水冲洗后，苏木素复染1min。常规脱水，透明，封片。
阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液，余同。
TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）
细胞凋亡中，
染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal
-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，
TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。
3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
蛋白酶K或胃蛋白酶消化0～20min。
0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
TdT缓冲液孵育10min。
TdT反应液37℃孵育1h。
切片浸泡在2×SSC溶液10min，以终止反应。
0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
0.04%的DAB显色5～10min，镜下控制时间。
苏木素复染3～5min，常规复水，透明和封片。
研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
