DNA印迹法实验步骤和注意事项
注意：操作戴手套。
凝胶处理
1)凝胶照相后切去包括标记带在内的多余部分。将凝胶的一角(·点第一个样品的一侧)切去作为标记 以便于定位。精确测量凝胶大小然后将凝胶放入一个方形瓷盘中 。
2)变性:将凝胶浸泡于适量的碱变性液中,室温下变性30分钟。期间更换变性液一次,不断地轻轻摇动。如果先进行酸变性酸变性,则凝胶中溴酚兰的颜色由黄变蓝对于较大的DNA片段(·如大于15kb)凝胶可在碱变性前用0.25mol/L HCl预处理10分钟使DNA片段脱嘌呤。凝胶中溴酚兰的颜色由黄变蓝后再进行碱变性。
3)中和:移去瓷盘中的碱变性溶液,用双蒸馏水漂洗凝胶两次,然后浸泡于适量的中和液中,室温下轻轻摇动15分钟,更换新鲜中和液,再中和15分钟。
膜处理
1)剪下一张与凝胶面积相同的硝酸纤维素膜(NCP)或尼龙膜,NL,。注意NCP也要剪去一角且不可用手触摸,粘有油腻的膜不能被湿润,也不能结合DNA。同时剪8,10张与NCP等大的干净滤纸
2)将NCP与3,4张滤纸依次漂浮于盛有双蒸馏水的带盖方盘中,使水自然从NCP的下面向上浸润,待其完全浸湿后,连同浸湿的滤纸一起浸入于转移液中浸泡5,10分钟。· 注意,在蒸馏水中如NCP表面有气泡时,可将其放在65水浴中浸泡几分中,仍有气泡或不能完全被湿润(膜上有白色或黄色斑块)则不能用于转移。
转移
1)取一个较大的方形瓷盘,放一块玻璃板于盘上,盘内加转移液(6×SSC或10×SSC)使液面距离玻璃底面约1,2cm,玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润的Whatman 3M ·滤纸(也可用新华滤纸),滤纸两端浸入SSC转移液中,用一玻璃棒将滤纸压平,滤纸与玻璃板间不得有气泡,
2)将琼脂糖凝胶翻转(样品孔朝下)后置于上述铺有Whatman 3M·滤纸的平台上,注意:两者之间不能有气泡。
3)用parafilm 蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严,防止在转移过程中因短路(转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶)使转移效率降低,甚至转移失败 ,
4)将处理好的NCP(已切去一角)小心地覆盖在凝胶上(滤膜的光泽面即标有N.C字样的一面朝向凝胶),NCP的一端与凝胶的上样孔对齐,切去的一角与凝胶切角的位置对齐。 注意,滤膜与凝胶之间不能有气泡,且NCP一旦与凝胶接触即不可再移动,因为从接触的一刻起,DNA已开始转移,
5)将预先用转移液浸润过的与NCP大小相同的Whatman 3M滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排出滤纸与膜之间的气泡,
6)再放几张相同大小的干滤纸和一叠厚约10,15cm的吸水纸于滤纸上,顶部压一块玻璃板和1kg左右的重物。
7)静置12,15小时使其充分转移,其间换吸水纸1,2次。转移液在吸水纸的虹吸作用下从盘中转移到吸水纸上,从而带动DNA从琼脂糖凝胶中转移到NCP上,
8)转移结束,移去吸水纸和滤纸,在NCP上用铅笔标上点样孔的位置。·将NCP浸泡在2×SSC中5分钟以去除琼脂糖碎块。将膜放置于一张干燥的新鲜滤纸上,
9)在紫外灯下观察凝胶和NCP膜,以了解DNA转移的情况。·在紫外灯下凝胶不显示荧光,NCP膜呈桔红色,并可见到条状的DNA带。
10)把NCP置于两层干燥新鲜的滤纸间,真空下80℃烘烤2小时(亦可用其它方法)。此过程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。
11)此NCP既可直接用于杂交,亦可用塑料薄膜密封,置,20℃冰箱保存备用。
注意事项
1,操作时戴手套,严禁用手接触凝胶和硝酸纤维素膜,
2,转移时,滤纸与膜、膜与凝胶、凝胶与滤纸桥之间均不能有气泡,否则影响DNA转移,
3,凝胶易碎,操作时应格外小心,
4,硝酸纤维素膜上的DNA固定非常重要,固定不好时DNA·在杂交过程中会脱落下来,烤膜温度过高,膜脆性增加,易碎,
5,大片段DNA转移效率低,可在碱变性前用0.25mol/L HCl浸泡凝胶10,15分钟,使DNA分子脱嘌呤或用短波(260mm)紫外光照射10,20分钟后再行碱变性、转移以提高大片段DNA的转移效率。
6,转移液中盐离子浓度对转移有较大影响。10×SSC条件适中,能有效地转移 1,20kb的DNA片段,速度也比20×SSC快,比较常用,6×SSC转移速度最快,·对于高分子量DNA片段(>10kb)的转移较理想,但小分子DNA易丢失。若转移DNA片段较小 ,则宜选用20×SSC。因此应根据不同目的选择适当的转移液。
