基因枪介导pVax-Dsred-IRES-EGFP质粒转染体外培养细...（一）
基因枪介导pVax-Dsred-IRES-EGFP质粒转染体外培养细胞系的实验研究
张 亮1 阎瑾琦1马继尧2 王 浩1 刘 宁1 贾锐1 韩 刚2 董金凯2 田仁礼2 于继云[1]
1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850； 2.解放军总医院 泌尿外科，北京 100853
[摘要]
目的：建立基因枪子弹制备以及转染体外培养cos-7细胞系的方法，观察基因枪介导真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP在细胞内的表达情况。
方法：亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹，利用原子力显微镜观察子弹制备（DNA+金颗粒）情况；以基因枪的方法分别转染对照组和实验组cos-7细胞，在转染后24小时，利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达。
结果：成功制备基因枪子弹，DNA紧密包裹在金颗粒周围。基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP成功转染入体外培养的cos-7细胞，在转染后24小时可检测到红、绿荧光的表达，而对照组则没有检测到荧光蛋白的表达。
结论：本实验证明国产新芝SJ-500型基因枪能够有效介导外源基因转移，基因枪转染的cos-7细胞能够有效表达报告基因，本研究为小鼠肿瘤模型的免疫治疗奠定了基础,为基因枪介导的DNA疫苗经皮免疫提供了可靠实验依据。
[关键词]
基因枪；细胞转染；真核表达载体；荧光蛋白；cos-7
基因治疗对于多种疾病，尤其是对恶性肿瘤、遗传性疾病、传染性疾病的治疗具有巨大的应用前景[1,2]。问题的关键在于如何建立一个安全、高效的基因导入系统，为此，人们试验和尝试发展了数十种病毒型和非病毒型载体运用于临床研究。然而，2000年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物临床试验造成了受试者死亡[3]，后来的研究发现病毒型载体有可能改变被转染细胞的主要功能和局部环境[4],从而引发了人们对病毒型载体安全性的忧虑。因此,以非病毒为载体的基因转移研究显得越发重要，其中基因枪法因其具有其他方法所不具有的高效和便捷的特点, 日益受到科研工作者的瞩目[5]。本研究室近期引进了国产新芝SJ-500型手提式基因枪，用于肿瘤免疫基因治疗的实验研究。为了验证该设备导入外源基因的有效性，遂进行本研究。在使用过程中发现利用基因枪转染基因方便、安全、有效，具有很好的临床应用前景。
1.1 材料
重组真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP为本室构建，为含有红、绿荧光蛋白报告基因的双顺反子真核表达载体质粒，可以在转染的真核核细胞中同时表达红、绿荧光蛋白；cos-7细胞为本室保存；DMEM培养基为Gibco BRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季青责任有限公司；新芝SJ-500型手提式基因枪、吹氮干燥仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；金粉购自AlFa Aesar；氦气、无水乙醇均为军事医学科学院科研条件处供应。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
将传代培养的cos-7细胞在转染前一天分至60mm细胞培养皿中培养，使其在转染当天生长密度达到80%-90%。对照组和实验组每组各3块培养板，对照组的子弹不加入质粒DNA，实验组子弹每发含有1.5μgDNA。子弹制备过程同1.2.2。
1.2.2 基因枪子弹制备
精确称取60mg金粉，加入1ml无水乙醇，超声波粉碎机超声3-5分钟，待手感发烫时12000rpm离心去除上清。在沉淀中加入1ml无水乙醇,混匀，12000rpm离心去除上清，重复上述过程二次，离心后在沉淀的金粉中加入1ml无水乙醇重悬,4℃冰箱保存。
制备子弹时，取400μl上述混合液离心，去除上清后加0.1M亚精氨160μl，轻轻混匀，然后加入1.5μg/μlpVax-Dsred-IRES-EGFP质粒50ul（空白组加入等量的去离子水），涡旋轻混时，逐滴加入2.5M氯化钙400μl，混匀后室温沉淀10分钟，待上清液变清亮离心15秒，去除上清，加入1ml无水乙醇重悬沉淀，12000rpm离心5秒，去上清，重复上述过程二次。加入3ml无水乙醇重悬沉淀。将金颗粒-质粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中,使金颗粒沉淀在管的内表面上,吸去乙醇,用氦气将管吹干,将管切成约1.5cm的小段即制成子弹。
1.2.3 基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP转染体外培养的cos-7细胞系
转染时，将培养皿中的细胞培养也液倒掉，将基因枪连接至氦气钢瓶，将压力调为1000kpa，轰击距离设定为2cm，轰击培养的cos-7细胞系一枪。对照组和实验组各轰击3块培养皿，转染pVax-DsRed-IRES-EGFP后,将细胞置入37℃,5%CO2孵箱继续培养。轰击后24小时,取对照组和实验组的细胞系在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。
