基因枪介导pVax-Dsred-IRES-EGFP质粒转染体外培养细胞
[摘要]
目的：建立基因枪子弹制备以及转染体外培养cos-7细胞系的方法，观察基因枪介导真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP在细胞内的表达情况。
方法：亚精氨、氯化钙沉淀法制备子弹，利用原子力显微镜观察子弹制备（DNA+金颗粒）情况；以基因枪的方法分别转染对照组和实验组cos-7细胞，在转染后24小时，利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达。
结果：成功制备基因枪子弹，DNA紧密包裹在金颗粒周围。基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP成功转染入体外培养的cos-7细胞，在转染后24小时可检测到红、绿荧光的表达，而对照组则没有检测到荧光蛋白的表达。
结论：本实验证明国产新芝SJ-500型基因枪能够有效介导外源基因转移，基因枪转染的cos-7细胞能够有效表达报告基因，本研究为小鼠肿瘤模型的免疫治疗奠定了基础,为基因枪介导的DNA疫苗经皮免疫提供了可靠实验依据。
[关键词]
基因枪；细胞转染；真核表达载体；荧光蛋白；cos-7
基因治疗对于多种疾病，尤其是对恶性肿瘤、遗传性疾病、传染性疾病的治疗具有巨大的应用前景[1,2]。问题的关键在于如何建立一个安全、高效的基因导入系统，为此，人们试验和尝试发展了数十种病毒型和非病毒型载体运用于临床研究。然而，2000年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物临床试验造成了受试者死亡[3]，后来的研究发现病毒型载体有可能改变被转染细胞的主要功能和局部环境[4],从而引发了人们对病毒型载体安全性的忧虑。因此,以非病毒为载体的基因转移研究显得越发重要，其中基因枪法因其具有其他方法所不具有的高效和便捷的特点, 日益受到科研工作者的瞩目[5]。本研究室近期引进了国产新芝SJ-500型手提式基因枪，用于肿瘤免疫基因治疗的实验研究。为了验证该设备导入外源基因的有效性，遂进行本研究。在使用过程中发现利用基因枪转染基因方便、安全、有效，具有很好的临床应用前景。
1 材料和方法
1.1
材料
重组真核表达质粒pVax-Dsred-IRES-EGFP为本室构建，为含有红、绿荧光蛋白报告基因的双顺反子真核表达载体质粒，可以在转染的真核核细胞中同时表达红、绿荧光蛋白；cos-7细胞为本室保存；DMEM培养基为Gibco BRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季青责任有限公司；新芝SJ-500型手提式基因枪、吹氮干燥仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司；金粉购自AlFa Aesar；氦气、无水乙醇均为军事医学科学院科研条件处供应。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
将传代培养的cos-7细胞在转染前一天分至60mm细胞培养皿中培养，使其在转染当天生长密度达到80%-90%。对照组和实验组每组各3块培养板，对照组的子弹不加入质粒DNA，实验组子弹每发含有1.5μgDNA。子弹制备过程同1.2.2。
1.2.2 基因枪子弹制备
精确称取60mg金粉，加入1ml无水乙醇，超声波粉碎机超声3-5分钟，待手感发烫时12000rpm离心去除上清。在沉淀中加入1ml无水乙醇,混匀，12000rpm离心去除上清，重复上述过程二次，离心后在沉淀的金粉中加入1ml无水乙醇重悬,4℃冰箱保存。
制备子弹时，取400μl上述混合液离心，去除上清后加0.1M亚精氨160μl，轻轻混匀，然后加入1.5μg/μlpVax-Dsred-IRES-EGFP质粒50ul（空白组加入等量的去离子水），涡旋轻混时，逐滴加入2.5M氯化钙400μl，混匀后室温沉淀10分钟，待上清液变清亮离心15秒，去除上清，加入1ml无水乙醇重悬沉淀，12000rpm离心5秒，去上清，重复上述过程二次。加入3ml无水乙醇重悬沉淀。将金颗粒-质粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中,使金颗粒沉淀在管的内表面上,吸去乙醇,用氦气将管吹干,将管切成约1.5cm的小段即制成子弹。
1.2.3 基因枪介导的pVax-Dsred-IRES-EGFP转染体外培养的cos-7细胞系
转染时，将培养皿中的细胞培养也液倒掉，将基因枪连接至氦气钢瓶，将压力调为1000kpa，轰击距离设定为2cm，轰击培养的cos-7细胞系一枪。对照组和实验组各轰击3块培养皿，转染pVax-DsRed-IRES-EGFP后,将细胞置入37℃,5%CO2孵箱继续培养。轰击后24小时,取对照组和实验组的细胞系在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。
2 结果
2.1 重组质粒pVax-DsRed-IRES-EGFP的酶切鉴定
pVax载体是被美国药品及食物鉴定委员会承认的用于疫苗临床使用的真核表达载体，它具有卡那霉素抗性，非常适合于人体的应用。制备基因枪子弹之前，先对本室构建保存的真核表达载体pVax-Dsred-IRES-EGFP进行双酶切鉴定，酶切位点如图1所示。经NsiI和BssHII双酶切，切下了大小约为745bp的EGFP片断；经BamHI和XhoI双酶切,切下了大小为2131bp的DsRed-IRES-EGFP片断，结果见图2。
图1 重组质粒pVax-DsRed-IRES-EGFP片段及酶切位点图谱
图2 pVax-DsRed-IRES-EGFP双酶切鉴定结果
M:DL2000 1,2:pVax-DsRed-IRES-EGFP经NsiI,BsshII双切 3,4:pVax-DsRed-IRES-EGFP经BamHI,XhoI双切
2.2 基因抢子弹制备结果
对于亚精氨、氯化钙沉淀法制备基因枪子弹的金颗粒与DNA的结合方式问题，国内外文献均没有明确报道，本文为了弄清楚上述问题，将亚精氨-氯化钙沉淀法制备的金颗粒-质粒DNA乙醇溶液稀释100倍，点样至云母上，进行原子力显微镜扫描，显示DNA能够有效包裹在金颗粒上，扫描结果如图3。
如图3A所示，金颗粒为表面光滑的圆形，直径约为1.5um，DNA包裹、缠绕在金颗粒的周围，使得金颗粒表面变得不再光滑，边界不再清楚，而呈现出不规则的椭圆形,如图3B。
图3 原子力显微镜扫描图
A:金颗粒 B:DNA包裹金颗粒形成的复合物
2.4 基因枪转染体外培养的cos-7细胞系结果
由于我们在红绿荧光蛋白片断间插入了双顺反子表达元件-----内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES) 序列，该序列来源于某些病毒和细胞的mRNA 5′端的一段非翻译区，因此在上游启动子的控制下，转录后为同一条mRNA；翻译时，IRES上游基因翻译起始遵循一般的真核生物基因的翻译起始规律，而IRES 下游基因则通过IRES 引导核糖体进入，启始基因的翻译，从而实现两个基因的同时表达[6-9]。通过lipofectaine2000瞬时转染体外培养细胞系证实, pVax-Dsred-IRES-EGFP能成功转入cos-7细胞并同时表达DsRed和EGFP基因。
本研究基因枪轰击细胞24h后，可在激光共聚显微镜下观察到红、绿色荧光以及共表达的黄光，而对照组的细胞则没有检测到荧光细胞的表达，如图3。该结果说明用基因枪方法成功将基因转染到细胞中并得到表达，结果见图4。
图3 对照组24小时激光扫描共聚焦显微镜图
A 明场细胞 B 对照组荧光图
图4 基因抢转染pVax-Dsred-IRES-EGFP24小时激光扫描共聚焦显微镜图
A 绿色荧光 B 红色荧光 C 明畅细胞 D红,绿荧光共表达
2讨论
基因枪技术, 又称为微粒轰击技术( Particle Bombardment Technology),其基本原理就是将外源基因包裹到比重较大而化学性质很稳定的微米级的金或钨上,然后用微粒加速装置打入靶细胞或组织。早期多用于在植物中转移基因。它通过提供给包裹有DNA的金颗粒很高的初速度,使其穿透植物的细胞壁,而达到质粒DNA有效的转移入细胞内的目的。随后,这项技术被应用于哺乳动物实验系统[10]。本实验所用的基因枪是依靠氦气提供给金颗粒很高的初速度,使其穿透靶细胞表面,将目的基因带入细胞。即使微颗粒被导入到细胞之间,作为异物的它们也可能诱导细胞产生吞噬作用,从而进一步增加外源基因进入细胞的概率。
非病毒基因递送系统是未来的发展方向,是现在基因治疗的热点研究内容, 基因枪作为一种纯物理的基因转移方法, 已成功地介导多种目地基因的体内外转移, 在肿瘤基因治疗中发挥着重要作用,基因枪技术在肿瘤基因治疗中必将发挥更大的作用。本试验研究可以说明国产新芝SJ-500型基因枪可以有效的转导外源基因，为小鼠肿瘤治疗模型的基因枪经皮免疫治疗奠定了坚实基础和可靠依据。目前报道较多的是美国BIO-RAD公司的Helios基因枪，而国产基因枪应用目前在国内报道很少，国产基因枪相对于进口枪，降低了科研成本，更加有利于推广。
而我们所使用的国产新芝SJ-500型手提式基因枪在转染体外培养的细胞系时，在使用过程中仍然发现一些不足之处，特别是转染效率尚不够高，这可能与金颗粒的大小，每颗子弹的携金量（MLQ）以及金颗粒上包裹的DNA量(DLR)、轰击枪数、轰击距离、轰击压力等诸多因素有关，还需要进一步进行研究和探索。
