基因枪介导pVax-Dsred-IRES-EGFP质粒转染体外培养细...（二）
2 结果 2.1 重组质粒pVax-DsRed-IRES-EGFP的酶切鉴定 pVax载体是被美国药品及食物鉴定委员会承认的用于疫苗临床使用的真核表达载体，它具有卡那霉素抗性，非常适合于人体的应用。制备基因枪子弹之前，先对本室构建保存的真核表达载体pVax-Dsred-IRES-EGFP进行双酶切鉴定，酶切位点如图1所示。经NsiI和BssHII双酶切，切下了大小约为745bp的EGFP片断；经BamHI和XhoI双酶切,切下了大小为2131bp的DsRed-IRES-EGFP片断，结果见图2。
图1 重组质粒pVax-DsRed-IRES-EGFP片段及酶切位点图谱
图2 pVax-DsRed-IRES-EGFP双酶切鉴定结果
M:DL2000 1,2:pVax-DsRed-IRES-EGFP经NsiI,BsshII双切 3,4:pVax-DsRed-IRES-EGFP经BamHI,XhoI双切 2.2 基因抢子弹制备结果 对于亚精氨、氯化钙沉淀法制备基因枪子弹的金颗粒与DNA的结合方式问题，国内外文献均没有明确报道，本文为了弄清楚上述问题，将亚精氨-氯化钙沉淀法制备的金颗粒-质粒DNA乙醇溶液稀释100倍，点样至云母上，进行原子力显微镜扫描，显示DNA能够有效包裹在金颗粒上，扫描结果如图3。 如图3A所示，金颗粒为表面光滑的圆形，直径约为1.5um，DNA包裹、缠绕在金颗粒的周围，使得金颗粒表面变得不再光滑，边界不再清楚，而呈现出不规则的椭圆形,如图3B。
图3 原子力显微镜扫描图 A:金颗粒 B:DNA包裹金颗粒形成的复合物 2.4 基因枪转染体外培养的cos-7细胞系结果 由于我们在红绿荧光蛋白片断间插入了双顺反子表达元件-----内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES) 序列，该序列来源于某些病毒和细胞的mRNA 5′端的一段非翻译区，因此在上游启动子的控制下，转录后为同一条mRNA；翻译时，IRES上游基因翻译起始遵循一般的真核生物基因的翻译起始规律，而IRES 下游基因则通过IRES 引导核糖体进入，启始基因的翻译，从而实现两个基因的同时表达[6-9]。通过lipofectaine2000瞬时转染体外培养细胞系证实, pVax-Dsred-IRES-EGFP能成功转入cos-7细胞并同时表达DsRed和EGFP基因。 本研究基因枪轰击细胞24h后，可在激光共聚显微镜下观察到红、绿色荧光以及共表达的黄光，而对照组的细胞则没有检测到荧光细胞的表达，如图3。该结果说明用基因枪方法成功将基因转染到细胞中并得到表达，结果见图4。
图3 对照组24小时激光扫描共聚焦显微镜图 A 明场细胞 B 对照组荧光图 
图4 基因抢转染pVax-Dsred-IRES-EGFP24小时激光扫描共聚焦显微镜图 A 绿色荧光 B 红色荧光 C 明畅细胞 D红,绿荧光共表达
