光谱染色体核型分析实验（二）
三、染色体标本预处理和变性
1.染色体标本至少自然老化2d或用前37℃过夜。
2.染色体标本在系列乙醇（70%、80%和95%)中分别脱水5min，晾干。
3.加入15〜20μL的10%胃蛋白酶储存液到50mL预热的0.01mol/L HCl中，将染色体标本在37℃染色缸中温育5min。同时，准备一缸70%甲酰胺/2×SSC溶液并放入75℃水浴中预热。
4.取出标本，在室温下的1×PBS中漂洗5min。
5.在1×PBS/MgCl2室温温育5min。
6.向50mL 1×PBS/MgCl2中加入1.5mL37%甲醛，在室温下的该溶液中温育标本10min。
7.在室温中的1×PBS中漂洗5min。
8.按步骤2中所述方法再次进行系列乙醇脱水。
9.晾干片子后，检查甲酰胺溶液的温度是否达到75℃;将染色体标本在75℃甲酰胺溶液中变性2min。
10.迅速将标本转移到冰冷的70%乙醇中并用系列乙醇脱水后晾干。
四、探针变性
1.对于每张标本，22mm×22mm盖玻片的范围内需要用10μL探针；如果该区域大于此范围，增加探针的使用量。取适量的探针到一个Eppendorf管中。
2.在水浴锅或PCR仪上75℃热变性探针10min。
3.将探针于37℃水浴中预复性1h。
五、杂交
1.从37℃中取出预复性的探针，小心的加到变性的中期染色体标本上。因为探针既有直接标记又有间接标记，应迅速操作并避免长时间暴露在光线条件下。
2.小心的盖上盖玻片，注意不要产生气泡。如果出现气泡，轻按盖玻片，将气泡挤出。
3.用橡皮泥封好盖玻片边缘。
4.放入杂交盒，并放入塑料袋中（可选择的），在37℃条件下杂交48h。
六、杂交后洗脱和检测
1.在45℃水浴中预热所有的溶液。
2.从杂交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。盖玻片也许随橡皮泥一块揭去或仍留在片子上。如果盖玻片留在片子上，直接将标本放入第一缸洗脱液。
3.在50%甲酰胺/2×SSC中洗3次，每次5min。在第一次洗脱时盖玻片应滑掉。轻轻振荡染色缸几秒钟。
4.在1×SSC中洗片3次，每次5min并轻轻振荡。
5.标本浸在0.01%Tween-20/4× SSC中，取出标本，甩掉多余的液体，但保持片子表面湿润。
6.取30〜40μL SKY试剂盒（AppliedSpectralImaging提供）的瓶2中的封闭液加到标本上，盖上盖玻片。
7.将标本放回杂交盒，37℃温育30min。
8.小心移开盖玻片，取30〜40pLSKY试剂盒的瓶3中的检测溶液加到片子上，并盖上盖玻片。
9.将标本放回杂交盒，37℃温育约30min。
10.小心移开盖玻片，在0.01%Tween-20/4× SSC中洗3次，每次5min。轻轻振荡。
11.甩掉多余的液体，取30〜40μL SKY试剂盒的瓶4中的检测溶液加到标本上，盖上盖玻片。
12.将标本放回杂交盒，37℃温育30min。
13.小心移开盖玻片，在0.01%Tween-20/4×SSC中洗片3次，每次5min。轻轻振荡。
14.在室温下的2×SSC中漂洗片子。
15.用15〜20μL瓶5中的DAPI/抗淬灭剂封片，盖上盖玻片，避免产生气泡。
16.可以进行阅片。标本应在-20℃保存。
七、图像抓取
1.尽可能及时的进行图像抓取和分析。尽管荧光素在-20℃并尽可能少的光线条件下能保存几个月，但随着时间的延长，信号强度会减弱。'
2.在实验室安装系统时进行用该系统抓取图像和分析的培训。
八、用SKY探针与曾G显带过的中期染色体标本的杂交：标本预处理
1.在室温下的二甲苯中洗2次，每次5min，除去G带标本上残留的镜油
2.将标本浸在甲醇中10〜15min褪色，或直到标本完全褪色。
3.标本褪色后，进行系列乙醇再水合：95%、80%和70%乙醇，每5min，瞭干。
4.继续从三的步骤5开始。
5.如果标本曾显带过，在70%甲酰胺/2×SSC中变性时间需调整以反映标本特性。保守变性时间为40s。
收起
注意事项
1.如果材料充足，尝试不同的秋水仙胺作用时间，以得到最适合细胞遗传学分析的染色体长度。通常，不同组织和肿瘤类型之间的生长模式也不同。对于生长较慢的细胞，秋水仙胺过夜处理能得到较多的中斯分裂相，但这种处理要求秋水仙胺的浓度相当得低。而对生长较快的细胞，秋水仙胺作用时间较短，可能只需要30min，就能够成功将大量细胞阻断在中期进行标本制备。通常建议在收获细胞前一天进行半量换液，从培养瓶中取出一半的培养基，加入等量的新鲜培养基。细胞对秋水仙胺的敏感性也是获得好的中期染色体分裂相的关键B素。试验发现：一些肿瘤细胞对秋水仙胺的耐受程度很低，很容易得到短粗的染色体。相应降低秋水仙胺的终浓度并延长作用时间可以在某种程度上减弱这种现象，但可能会导致一定数量的中期染色体分裂相减少。
2.培养基中既有悬浮细胞也有贴壁细胞时，为保证标本制备中收集到所有的肿瘤细胞，建议同时收集悬浮在培基中的细胞。收集后，将这些细胞加入到胰酶处理得到的其他贴壁细胞中。
3.用含有胎牛血清的新鲜培养基漂洗收集的细胞有助于灭活胰蛋白酶。既然胰蛋白酶是一种蛋白酶，过长时间的胰蛋白酶处理会破坏细胞膜、损伤DNA。
4．KCl通常用作低渗液使细胞胀大。最初的1mL溶液要逐滴加入，防止水液体的冲击造成细胞破裂释放细胞内容物。加入每滴溶液后都轻轻混匀，确保低渗液和细胞悬液混匀。37℃的微热处理令细胞胀大得更快。如果没有37℃温育，室温放置30min也能充分的胀大细胞。如果细胞没有胀大，依次延长低渗温育时间5min再进行随后的收获步骤。
5.低渗胀大后的细胞非常敏感。逐滴加入甲醇：冰乙酸固定液进行预固定，有助于坚固细胞膜以进行之后的离心和固定。加入固定液也会破碎所有的红细胞。离心后，细胞团块的大小应会加倍，说明低渗处理的成功。
6.细胞离心成团后，去上清。上清中可能含有破碎的膜和细胞质物质。轻敲锥形离心管底使细胞团块重悬。逐滴加人固定液有助于使固定液缓慢进入胀大的敏感细胞。
7.有许多种方法可用来进行中期染色体标本的制备。某些实验室用1mL—次性球形吸管、玻璃滴管或移液枪将固定好的细胞滴加到载玻片上。尤其当细胞数量少时用200μL的移液枪便于控制细胞悬液的使用量。细胞悬液通常滴加到倾斜45°角的载玻片上，可以是干片，也可以是浸在水或固定液中的湿片。这些不同的制片方法来自于不断摸索。比较潮湿的房间或季节会影响制片效果。如果空气太干燥，用加湿器或用沸腾的壶水或电热板加热水产生的水蒸气来提高空气湿度。如果环境太潮湿，将玻片放在电热板上几秒钟，加快干燥速度。制备的标本需经常在相差显微镜下观察，以确定目前的制片方法是否合适。为确保SKY实验的成功，标本上分裂相周围的胞质尽可能得少、染色体不能太长或相互交叉。根据需要调节细胞浓度。通常染色体呈深灰色，依稀能看见带型。标本可以保存在室温下的玻片盒中，并在两周内使用，也可在第二天尽快使用。当标本开始老化后，将更难于变性，发生降解使DNA毫无用处。
8.胃蛋白酶是用于前处理的最温和的蛋白酶。配制10%(m/V)的胃蛋白酶储存液并分装，可以在-20℃条件下几乎永久保存。按每次的使用量分装胃蛋白酶。每一批新的胃蛋白酶都是不同的，因此获得最干净标本的前处理的使用量可能不同。
9.一种能控制蛋白质消化程度的保守方法是用等量的胃蛋白酶，但延长温育时间。提高胃蛋白酶的使用量要求更严格的计时，相形比之下前一种方法更有弹性。轻轻振荡能够促进胞质碎片的松开。蛋白酶处理后可以在相差显微镜下观,察蛋白质的消化程度，但需要在甲醛固定之前。
10.甲醛有助于维持染色体形态，但也造成DNA难于变性。尽管2min的变性时间足以将DNA成为单链，对于片龄比较长的标本（超过2个月）甲醛处理可使变性时间缩短。如果是片龄比较长的标本，缩短甲醛处理时间到5min。之前曾G显带过的标本，经过胰酶消化显带和热处理人工老化的剧烈处理，用甲醛固定有助于维持染色体的形态
11.用甲酰胺作变性液，因为它能够降低DNA的熔点。用温度计测量保证甲酰胺溶液达到变性温度。塑料染色缸内的溶液一般比外面水浴锅的温度低3〜4℃，因此应提髙水浴锅的温度。玻璃染色缸更易于传热；在染色缸中每加一张标本溶液温度会降低，因此每增加一张变性标本水浴锅的温度就大约上调TC。所以，使用玻璃染色缸变性5张标本时，水浴锅的温度应设定在78〜79℃，这样变性液的温度在74〜75℃。2min是变性的标准时间，然而，可以根据标本的质量和片龄调整变性时间。对于新鲜制备的标本（片龄1〜3d)，DNA可能还没有完全老化，尽管用甲醛固定促进老化，但DNA仍然很脆弱，将变性时间缩短到90s就足够了。杂交后在显微镜下观察确定标本是否过度变性，染色体可能发生胀大，沿着每条染色体或染色单体的轴具有可见的骨架，或者边缘清晰但染色黯淡的染色体。变性过度的标本不能像适当变性的标本一样被DAPI复染，一般只有着丝粒呈现亮荧光染色。因为过度变性破坏了DNA结构，也可能只有少数.探针与靶DNA杂交。片子变性不够的时候，镜下观察到染色体完整但杂交信号分布不均。染色体容易被DAPI着色，说明DNA没有被过度处理，结构没有被破坏。
12.标本变性是FISH相关试验最关键的步骤。标本变性结束，必须立刻转移到70%的乙醇中以保持DNA的单链状态，乙醇可以是冰冷或室温的。并不需要每一步都更换乙醇，70%乙醇可以一次试验后进行更换，80%和95%乙醇可以一次加满后，每2次试验后进行补充。如果没有条件在-20℃保存乙醇，也可以室温保存，但是必须密闭保存以免蒸发。
13.任何不透光的容器都可以作为杂交盒，黑色录像带盒就是一种非常好的杂交盒。尽管盒子并不需要潮湿，但我们的经验是用一片湿纸巾或湿纱布（不要湿透）垫在盒底会有利于杂交。一定要用干净的蒸馏水，因为细菌可能会在片子上生长，与抗体结合后产生不必要的背景。也可以选择将杂交盒放在塑料袋中，防止杂交盒干透。杂交后的所有洗脱都应该伴随轻轻振荡，将未结合的抗体或探针洗脱下来使标本干净；确保所有试剂中无可以结合抗体的任何细菌。如果在UV显微镜下背景很高，应加大洗脱力度：每一步增加一次洗脱并更剧烈的振荡，或调节溶液浓度。以Tween-20的浓度为例，可以在0.01%〜0.2%进行调节。洗脱或抗体温育的过程中如果标本干了，也会产生背景。
15.之前曾进行过G显带的标本通常是来自临床细胞遗传学实验室的唯一样品来源。这些标本的保存和预处理使进行随后的FISH分析难度很大；然而有几步操作可以提高其FISH的成功率。表1列出一些要进行SKY分析的G带标本制备应遵循的原则。G带分析后，这些标本可以用二甲苯或其他试剂处理去除残留镜油，因为这些镜油能快速降解DNA。如果标本已经封片，封片剂也可能降解DNA，这可能是无法避免的，但是通过调节蛋白酶处理（这步可以省略因为G显带标本用胰蛋白酶处理过）、变性时间和甲醛固定等，以避免进一步损坏DNA。
16.之前进行过G显带的标本变性时应调节变性时间。在G显带过程中，DNA已经剧烈作用过，包括胰酶消化去掉细胞质和一些与DNA结合的蛋白质而强化带型，高温处理得到反差更好的染色带型。加上浸在镜油中，靶DNA通常是相当脆弱的状态，因此变性时间缩短到40s。也可以在正式实验前，用同样制备和处理方式的其他来源标本进行预实验。这将为分析是否有效、标本可以承受多少处理提供依据。
17.尽量拍摄周围无细胞核的中期染色体分裂相。虽然染色体的荧光通常跟周围的核一样或更强一些，但较小的细胞核发出的非常强的荧光将改变中期染色体分裂相的荧光强度，因为抓取图像时会自动调节对比度。
18.抓取图像的时候尽量避免拍到明亮的斑点。和上面所述的原因相同，.结合抗体造成的外源性亮点不能被洗脱掉，会导致靶染色体的信号强度降低。
19.如果可能，尽量选择相互交叉少的中期染色体分裂相。但在中期染色体分裂相数量很少或者细胞悬液中染色体长时这种情况就不可避免。染色体的交叉可能导致“易位”的错误判断，因为染色体交叉结合在一起形成的荧光组合可能与SKY光谱库中的某种模式一致。
20.为节省硬盘空间和缩短图像抓取时间，只选择有意义的中期染色体分裂相进行图像抓取，而避开中期分裂相周围的大片无信号区域。
