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二次鉴别性消化法检测磷酸肽中特定氨基酸实验

2019.3.29

实验材料	洗脱的磷酸肽
试剂、试剂盒	消化酶消化缓冲液 2-巯基乙醇合适 pH 的电泳缓冲
仪器、耗材	适合于酶消化的温度的水浴 TLC 平板（20 cm × 20 cm 100 维素）
实验步骤	1. 在微量离心管中用 50 μl 合适的缓冲液溶解洗脱下的磷酸肽，短暂离心在管底收集所有的溶液。取 1 μl 肽溶液滴加到 pH 试纸上检测其 pH，确保最终的 pH 适宜于酶的活性。如果加入肽后溶液的 pH 发生剧变，调整好 pH 后再加入酶。 2. 取出一部分（通常为 50%）样品，作为未消化的对照和作为与消化样品混合的一部分。 3. 加入 1～2 μg 酶到待消化的样品中，涡旋振荡，短暂离心使样品集中到管底。 4. 将所有管子放于合适温度的水浴中至少孵育 1 h。 5. 再加入一份酶，继续孵育 1 h。 6. 往每个样品中加入 1 μl 2-巯基乙醇，煮 5 min 以使酶失活。 7. 在 SpeedVac 蒸发器中冻干样品。 8. 将样品重悬于 6 μl 合适 pH 的电泳缓冲液中，剧烈地涡旋振荡混合以使样品溶解。全速离心以使不溶解的物质沉淀下来。 9. 取一半未消化的样品点样于一块 TLC 平板上。将已消化的样品对半分为两份，分别点样到两块 TLC 平板上，其中一块再点上另一半的未消化的样品作为混合物。 10. 在平板上进行电泳和层析（基本方案 1 步骤 24～31）。根据所分析的特定磷酸肽在原始图谱上的位置选择合适的 pH 以及电泳和层析的时间，尽可能使肽和它的可能降解产物很好分离，同时确保小的降解产物能留在平板上。展开
注意事项	在分析已消化和未消化样品的混合物时必须完全使酶失活后再将样品点到平板上，否则当两个样品混合后未消化的样品会被很快消化掉。
其他	洗脱的磷酸肽的准备可见来ＸＸ实验的辅助方案。