土霉素、金霉素和四环素的检测方法
1、 分析目标化合物:
土霉素,金霉素,四环素
2、 仪器设备:
带荧光检测器的高效液相色谱仪,
3、 试剂:
除下列试剂外,使用附录2所列试剂,
咪唑:特级
咪唑缓冲溶液:将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中,用乙酸调节pH7.2后,加水至1,000mL,
含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液:第1液:将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质,
4、 标准品:
盐酸土霉素:本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价,分解点为190℃～194℃,
盐酸金霉素:本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价,分解点为210℃以上,
盐酸四环素:本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力,分解点为214℃以上,
5、 试验溶液的制备:
A．提取方法:
①肌肉、肝脏和肾脏
肌肉:尽可能除去脂肪层,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,
肝脏和肾脏:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心分离管的残留物中 加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于上述分液漏斗中,加入20mL正己 烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,
②脂肪
脂肪:尽可能除去肌肉层,搅碎混合均匀后,称取其20.0g,
加入200mL正己烷,搅拌1分钟后,加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,再搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,正 己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,分取水层,合并于先分取的水层中,
③奶
称取5.00g样品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷,用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,
④蛋
除去蛋壳,充分均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,均匀后,加入100mL正己烷,搅拌1分钟后,以每分钟3000 转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述 同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,
⑤鱼贝类
有壳贝类:除去壳,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,
其它的鱼贝类:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器 激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,
B．净化方法:
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,顺次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA溶液,弃去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液后,注入10mL水,弃去流出液,注入10mL甲醇,收集 流出液于磨口减压浓缩器中,40℃以下除去甲醇,残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解,此为试验溶液,
6、操作方法:
A．定性试验
按下列操作条件进行试验,试验结果必须与标准品的一致,
操作条件:
柱填充剂:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm),
柱:内径4.0～6.0mm,长150mm不锈钢管,
柱温: 40℃
检测器:激发波长380nm,发射波长520nm,
流动相:土霉素和四环素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,调整流速使土霉素约5分钟流出,
金霉素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,调整流速使金霉素约7分钟流出,
B．定量试验
根据与A定性试验相同操作条件所得的试验结果,峰高法或峰面积法定量,
7、定量限:
A．肌肉,肝脏,肾脏,奶,蛋和鱼贝类
土霉素:0.02mg/kg
金霉素:0.03mg/kg
四环素:0.02mg/kg
B．脂肪
土霉素:0.005 mg/kg
8、注意事项:
(1)试验溶液的制备:
①离心分离温度保持在室温,
②抽滤后滤液混浊时,滤液再次进行离心分离,
③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色谱中,注入试验溶液后,30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸,
(2)标准溶液的配制:
①称取相当于10.0mg土霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,
②称取相当于10.0mg金霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,
③称取相当于10.0mg四环素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,
④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素,金霉素和四环素各标准原液递减稀释,作为制作标准曲线用的标准溶液,
(3)其它:
①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时,用「土霉素,金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的,不妨用本检测方法实施试验,
②使用本检测方法检出土霉素,金霉素和四环素时,最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证.
