酵母蔗糖酶的制备实验
研磨法
| 实验方法原理 |
蔗糖酶( inver tase ) (β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranosidefructohydrolase ) ( EC. 3 . 2 . 1 . 26 ) 特异地催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解, 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶, 通过研磨破细胞壁, 使酶游离出来, 用水萃取酶, 然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品,还可用柱层析进一步纯化得到精制品。 |
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| 实验材料 | 啤酒酵母 |
| 试剂、试剂盒 | 二氧化硅 去离子水 冰块 食盐 乙酸 乙醇 |
| 仪器、耗材 | 研钵 离心管 滴管 量筒 恒温水浴锅 烧杯 pH试纸 高速冷冻离心机 |
| 实验步骤 |
1. 提取 （1）准备一个冰浴, 将研钵稳妥地放入冰浴中。 （2）称取10 g 湿啤酒酵母, 和适量( 约5 g) 二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。
（3）缓慢加入预冷的30 ml 去离子水, 每次加2 ml 左右, 边加边研磨, 至少用30 分钟。至酵母细胞大部分研碎, 以便将蔗糖酶充分转入水相。
（4）(可选项) 研磨时用显微镜检查研磨的效果。 （5）将混合物转入两个离心管中, 平衡后, 用高速冷冻离心机离心, 4 ℃ , 10 000 r/ min , 离心15 min。
（6）用滴管小心地取出水相, 转入另一个清洁的离心管中,4 ℃ , 10 000 r/ min , 离心15 min。
（7）将上清液转入量筒, 量出体积。用广泛pH 试纸检查上清液pH, 用1 mol/ L 乙酸将pH 调至5.0 , 称为级分I。留出1.5 ml 测定酶活力及蛋白含量, 剩余部分转入清洁离心管中。 （1）预先将恒温水浴调到50 ℃ , 将盛有级分Ⅰ 的离心管稳妥地放入水浴中, 50 ℃下保温30 分钟, 在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管, 于冰浴中迅速冷却, 4 ℃ , 10 000 r/ min ,离心10 min。
（3）将上清液转入小烧杯中, 放入冰盐浴( 没有水的碎冰撒入少量食盐) , 缓慢地加入等体积预冷至- 20 ℃的95%乙醇, 同时轻轻搅拌, 再在冰盐浴中放置10 分钟, 以沉淀完全。于4 ℃ ,10 000 r/ min , 离心10 min , 倾去上清液, 并滴干, 沉淀保存于离心管中, 盖上盖子或薄膜封口, 然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为 级分Ⅱ)。
废弃上清液之前, 要用尿糖试纸检查其酶活性( 与下一个实验一起做)。
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