同功酶遗传标记分析
实验概要
1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
2. 同工酶遗传标记的分析
实验原理
同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶，其分子的多种形式是由基因决定的，即基因表达的直接产物。由同一基因座的不同等位基因编码的各种同工酶又称为等位酶，它们从分子水平上反映了等位基因的相对差异。因此，同工酶不仅是一种生理生化指标，而且也是一种可靠的遗传标记。
在同工酶分析和鉴定中，电泳法应用最为广泛，它能简便、快捷地分离某类酶的各同工酶组分，而不破坏酶的活力。电泳的支持介质——聚丙烯酰胺又是目前最常用的，它是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构。丙烯酰胺的单体和双体的聚合有两种类型，一种是化学聚合，常采用过硫酸胺——四甲基乙二胺（TEMED）催化系统。过硫酸胺是引发基团，供给游离氧基，TEMED是催化加速剂。另一种是光照聚合。常采用核黄素——TEMED催化系统。核黄素在光下形成无色基，TEMED放氧再氧化，产生自由基，从而引发聚合作用。制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度（100毫升凝胶溶液中含有单体和交联剂总克数）决定。当采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系时，一般上层是大孔径的浓缩胶（pH
6.7），下层为小孔径的分离胶（pH 8.9），电泳缓冲液为Tris－甘氨酸缓冲液（pH
8.3）。在这种不连续系统里，存在着电荷效应，分子筛效应和浓缩效应。蛋白质（酶）按其电荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上。用此凝胶板与酶反应底物进行催化反应，再用生物染料染色便形成肉眼可见各种酶带。
据研究认为以萘乙酸酯为底物的同工酶属于羧基的酯酶类，为单体或二聚体的蛋白质。酯酶同工酶中也存在等位酶，表现出共显性的遗传特性。因此，酯酶同工酶可以作为孟德尔遗传的一种分子标记。
本实验所用的材料为我省种植面积较大的水稻品种特优63，其父母本和杂种F1酶带有差异。酶带的差异反映其基因型的差别。父本和母本有两条酶带上的差别，杂种F1是双亲这两条酶带的互补带。
主要试剂
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、过硫酸铵、核黄素、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 HCl、蔗糖、乙醇、丙酮、维生素C、半胱氨酸、MgCl2、硫基乙醇、TEMED、溴酚兰、坚牢蓝RR、α－萘酯。
主要设备
电泳仪，电泳槽，离心机，冰箱，移液管。
实验材料
水稻（Oryza Sativa）：龙特浦A、明恢63，特优63（F1），F2四种植株群体的幼苗。
实验步骤
1、溶液配制
（1）样品提取液
0.35M蔗糖、5mM vit c、3mM半胱氨酸、1mM MgCl2、5mM硫基乙酸、50mM Tris。
（2）分离胶（A:B:C:D＝1:2:1:4）pH 8.9
A、甲液（100ml）
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 36.6g
四甲基乙二胺（TEMED） 0.46ml
1N HCl 48ml（84ml浓HCl定容至1000ml成1N HCl）
B、丙液（100ml）
丙烯酰胺（Acr）28.0g
甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.753g
C、蒸馏水
D、0.28％过硫酸胺（现用现配）
（3）浓缩胶（a:b:c:d=1:2:1:4）
a、乙液（100ml）pH 6.7
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 5.98g
四甲基乙二胺（TEMED） 0.46ml
1N HCl 48ml
b、丁液（100ml）
丙烯酰胺（Acr）10.0g
甲叉双丙烯酰胺（Bis）2.5g
c、戊液（100ml）
核黄素 4mg
d、己液（100ml）
蔗糖 40g
（4）电泳缓冲液母液（pH8.3）1000ml
Tris 6.0g
甘氨酸 28.8g
用时稀释10倍
（5）前沿指示剂
溴酚蓝 1％
（6）磷酸缓冲液
0.2M Na2HPO4
0.2M NaH2PO4
（7）染色液（酯酶）
磷酸缓冲液（pH6.4）90ml
坚牢蓝RR 0.1g
1％α－萘酯 10ml（以少许丙酮溶解后，用80％酒精配制）
2、操作步骤
（1）清洗：玻璃板、橡胶密封圈、电泳槽
（2）装板：将高、矮玻璃板各一片，矮板嵌入橡胶圈内圈，高板装在外圈
（3）装槽：将装好的玻璃各两组装到电泳槽上，两高玻璃板相对，两矮玻璃板朝外，旋紧螺丝，防止漏胶。
（4）封边：用滚烫的2％琼脂沿高玻璃板的底边灌注约0.5－1.0厘米。
（5）配灌分离胶：按溶液A:B:C:D＝1:2:1:4比例（胶浓度＝7.2％）配制分离胶，混合均匀，不要有气泡，沿着玻璃板壁缓缓倒入电泳槽上的玻璃板夹层里到一定的高度。
（6）隔氧：在上述分离胶上立即滴一层蒸馏水，隔绝空气，促进聚合。
（7）分离胶化学聚合：分离胶在28℃左右约30~40min可聚合，可透过玻璃看到胶与水之间出现界面时，表明凝胶已聚合好。
（8）配灌浓缩胶：分离胶聚合后，吸去上部的水分，按溶液a:b:c:d＝1:2:1:4比例（胶浓度＝3.1％），配制浓缩胶，混合均匀，灌入玻璃板夹层到顶部。
（9）制备加样口：将1mm厚的“样品梳子”（50个板品）插入浓缩胶溶液中。
（10）浓缩胶光照聚合：将灌制好的凝胶板置于自然光照条件下（或40W日光灯下）聚合1小时左右。直到界面出现乳白色，说明浓缩胶已聚合好。
（11）制备样品：取2厘米左右的水稻幼苗于0.5ml的Eppendorff管中，加入样品提液70~80ml，用捣样器捣烂后，离心后置冰箱备用，每组制备龙特浦A、明恢63、F1各5株样品，F2样品85株。（制备的每个样品插于塑料泡沫内）。
（12）加样：将浓缩胶上端的“样品梳”小心取出（若样品孔中有多余水份，用注射针吸干），每一样品孔，按顺序用移液枪加入15μl的上述制备的样品。
（13）稳压稳流电泳：在电泳槽的内层（正极）和外槽（负极）应加入Tris－甘氨酸电泳缓冲液（母液稀释10倍），负极方向的电泳缓冲液量应超过其玻璃板（矮板），电泳槽的正负极与电泳仪的正负极要对应连接。插上电源，调整电压到220v，并使之处于稳流状态。在电泳槽的负极处滴两滴1％溴酚兰，作为电泳的前沿指示剂。待前沿指示剂离凝胶板底部1厘米时，停止电泳，即调整电压到0点，关掉电源开关，取下电泳槽的电极连线。
（14）卸凝胶板：倒去电泳槽中的电泳缓冲液，旋松螺丝，卸下两组玻璃凝胶板，去掉橡胶密封。
（15）剥离分离板：轻轻撬开每组玻璃凝胶板的高低两片玻璃，去除凝胶板中的上部浓缩胶和底部的封边琼脂。小心剥离分离胶于染色缸中，或将带分离胶玻璃板浸泡于清水中，利用水的浮力剥离分离胶。然后再将凝胶小心滑入染色缸中。
（16）染色：将0.2M磷酸缓冲液（pH6.4）90ml和1％α－萘酯10ml倒入染色缸中。37℃轻轻振荡，让分离胶与底物充分接触起酶促反应，10分钟后加入生物染色剂坚牢蓝RR 100mg，继续振荡，直到酶带清晰为止（染色不要过长）。
（17）观察纪录：染色好的凝胶倒去染色液，用清水洗3~4遍，置于透光箱上观察酯酶同工酶的酶带，及其变化情况。
