核酸亲和层析法纯化蛋白质实验
步骤一 偶联寡核苷酸到溴化氰活化的 Sepharose 4B
步骤二 核酸亲和层析
| 实验方法原理 |
DNA 偶联至溴化氰活化的 Sepharcse 4B 是通过它们本身的碱基实现的。从理论上讲，该方法也许干扰最佳结合序列的接近路径，但是这样一个简单的方法一直被广泛地成功应用。偶联效率的定量检测可经 A260 值测定评估，或者更精确地从偶联介质上水解核酸和进行磷酸盐测定。 |
|---|---|
| 实验材料 | 寡核苷酸 |
| 试剂、试剂盒 | HCl KCl 乙醇胺-盐酸 磷酸钾缓冲液 储存缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 烧结玻璃漏斗 聚丙烯试管 |
| 实验步骤 |
1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中，室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤，当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候，立即停止抽滤； 2. 胶在漏斗内，依次用 4℃，200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L，pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗； 3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L，pH 8.0 磷酸钾缓冲液的 15 ml 试管内； 4. 加 50 ul 寡核苷酸到试管，约每 ml 胶需用 2nmol 寡核苷酸。室温下振摇 16 h； 5. 再移入烧结玻璃漏斗，抽滤除去液体； 6. 先后用 200 ml 水和 100 ml 1 mol/L，pH 8.0 乙醇胺-盐酸清洗； 7. 将胶移入聚丙烯试管，在 7 ml 1 mol/L，pH 8.0 乙醇胺-盐酸中混悬。室温下摇 4～6 h。该步骤灭活未偶联的活化的胶； 8. 在烧结漏斗中，依次用下述溶液洗胶。100 ml 10 mol/L，pH 8.0 磷酸钾缓冲液；100 ml 1 mol/L，pH 8.0 磷酸钾缓冲液；100 ml 1 mol/L KCl；100 ml H2O；100 ml 储存缓冲液（10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl，0.3 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.02％ NaN3； 9. 4℃可储存一年。 |
