测序入门：接头家族大揭秘
在高通量测序技术日益成熟的今天，相信大家或多或少都对文库制备实验有所了解，而文库制备的目的,就是为了在目标DNA序列两端连接上特异的接头，从而能够在测序平台上机测序。那今天，我们就来扒一扒关于Illumina平台文库接头的那些事儿吧。
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接头结构
接头作为文库的必要组成部分，包括P5/P7、Index以及R1
SP/R2
SP序列。其中P5/P7序列能够跟测序芯片上的P5/P7序列互补和相同，只有这样才能将待测片段固定在Flowcell上进行桥式PCR扩增；Index又称为barcode，目的是给文库加上特定的标签，用于文库混合测序时区分不同的文库样本；R1
SP/R2
SP是Read1和Read2测序引物结合的区域，在dNTP和DNA聚合酶的作用下能够进行碱基的延伸。下图是接头的一般结构，呈“Y”字型。
图1：接头的一般结构
“Y”型接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而可以通过后续的PCR扩增形成两端带有不同核苷酸序列（P5/P7）的文库。
图2：文库的一般结构（中间灰色部分为待测序列）
接头如何分类
01
单/双端Index接头
根据Index位置的不同，接头可以分为单端和双端Index接头。单端Index接头只在P7端存在Index序列，双端Index接头在P5和P7两端均存在Index序列。一般而言，Index序列的碱基数为6
nt或8
nt。以8碱基Index序列为例，单端Index组合理论上可以有48种，双端Index组合理论上可以有416种。但是，考虑到测序时Index组合要满足碱基平衡和激光平衡原则，实际可供选择的Index种类为数不多。目前双端Index组合最多高达3840种，这直接影响最终文库混合上机能够混合的样本数。
目前，测序仪的测序能力远大于测试样本数据量，例如Hiseq、Novaseq等，为避免仪器浪费，就需要更多样的文库标签来区分不同的文库样本，因此双端Index接头的应用更为广泛。
图3：双端Index结构
注：由于Illumina不同机型双Index
PE测序策略不同，i5端Index 2的读取方式也有所不同。如测序平台为Miniseq，Nextseq，Hiseq
3000/4000，Hiseq X等机型时，Index 2序列需要进行反向互补后再输入到sample sheet中。
02
长接头和短接头
根据能否匹配PCR-free文库，接头又可以分为长接头（完整的Y型）和短接头（不完整的Y型接头）。长接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端，在文库产量足够的情况下，可不进行PCR扩增直接上机测序；而短接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端后，必须使用与短接头互补的Indexing
Primers进行PCR扩增成为完整接头后，才能上机测序。造成上述区别的主要原因是长短接头引入Index序列的方式有所不同。
图4：长短接头Index序列不同引入方式
注：长接头连接产物扩增时，引物序列只需要与P5/P7互补即可，而短接头连接产物扩增时，引物序列还需要包含有Index。
03
UDI & UMI接头
2017年，Illumina公司推出了“测序洗衣机”型号——NovaSeq
6000，这款仪器的特点在于运用了ExAmp扩增方式和Patterned flow cell样品槽，2天能产出高达6
Tb的数据，为更大规模的全基因组测序带来了希望。新技术的应用虽然大大增加了扩增效率，使得通量更高、成本更低，但同时也加大了游离接头的干扰，导至出现标签跳跃（Index
hopping）问题。
图5：标签跳跃百分比与加入的接头水平的曲线[1]
为了解决Patterned
Flow Cell测序平台（Hiseq系列、Novaseq等）凸显的标签跳跃问题，Illumina提出了“Prepare dual
Indexed libraries with unique Indexes”的策略，即在文库的P5和P7端带上独特的标签—UDI（Unique
dual Index），通过P5 Index 2和P7 Index
1成组设计，两端Index交叉验证，从而能够有效降低Index错误分配的现象。
此外，在极低频突变检测中，避免假阳性是液体活检格外关心的重要一环。应用分子标签技术，能够分辨出检测到的突变是真实的低频突变还是来源于测序错误和PCR扩增错误，从而过滤掉背景噪音，实现低频突变的准确检测。
而分子标签UMI（Unique
Molecular
Identifiers）通常设计为完全随机的核苷酸链（如NNNNNN）、部分简并核苷酸链（如NNNRNYN）或者固定核苷酸链（当模板分子有限的情况下）。NGS文库构建过程中，在UDI接头结构的基础上引入UMI标签，通过对原始DNA分子片段进行标记，能够验证测序结果在原始DNA序列上的一致性，从而剔除假阳性突变。
如上图所示，三个分子被测了5次，其中左侧和右侧均有测序错误，但该错误并没有在每个测序数据中出现，所以在后续合成一个分子的时候，测序错误被修正，只保留了真正的突变。
目前这种新型的UMI接头包含三种元件，即P5 Index、P7 Index以及UMI元件。根据UMI标签引入接头的位置—紧随P7端Index或位于插入片段两端，又分为两种不同的接头类型：
注1：转座酶文库不是通过TA连接的方式连接接头，其引入Index的方式与非完整接头类似，即转座酶切的过程中引入R1 SP和R2 SP，再经过PCR扩增引入Index和P5/P7序列，最终形成完整的文库。
注2：Small RNA文库亦不是通过TA连接的方式连接接头，而是将Small RNA的3’和5’端分别与通用接头连接，经过逆转录、PCR扩增得到Small RNA文库。
参考文献：
[1]
https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/whitepapers/Index-hopping-white-paper-770-2017-004.pdf
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