分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

不同高灵敏相机在数字PCR的使用操作区别

2021.3.01

PCR即聚合酶链式反应，就是一种将特定的DNA片段放大扩增的分子生物学技术, 可以将微量DNA片段扩增成便于检测的海量目的基因片段，可将PCR看作是生物体外的特殊DNA复制。

最传统的“第一代PCR”采用琼脂糖电泳的方法对PCR产物进行分析，但该方法操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大。为了避免上述缺陷，同时满足对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了 “第二代PCR”——实时荧光定量PCR。

▲琼脂糖电泳仪及实验图片

实时荧光定量PCR是指在PCR扩增的同时对反应体系中的荧光信号进行实时收集，而在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，最终才可确定目的基因的拷贝数或基因的表达水平。这种方法检测灵敏度不够，无法做到绝对定量，此时“第三代PCR”，数字PCR应运而生。

▲随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数

数字PCR是将一个DNA样品分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，这些反应单元称为微滴，每个微滴中都会对目标基因进行扩增，扩增结束后对荧光信号进行统计分析。最终能够直接数出DNA分子的个数，从而对起始DNA样品绝对定量。

该方法在统计分析时,不依赖于标准曲线和参照样本,可直接检测目标序列的拷贝数,使得检测灵敏度,精确性大大提高。因而在极微量DNA样本检测、复杂成分中微量检测、稀有突变检测等需要高精度定量分析领域具有优势。

▲数字PCR流程大致分为：样品制备、目标基因分配、RCR扩增、结果读出

近几年生命科学行业的发展大家有目共睹，数字PCR检测也得到了更广泛的应用，未来其在临床也将拥有更大的应用前景。目前已在极微量核酸样本检测、基因表达研究、癌症标志物稀有突变检测、肿瘤个体化诊疗、无创产前检查、转基因成分鉴定等诸多方面具有广阔应用。

数字PCR：高灵敏相机你过来啊！

数字PCR对荧光信号分析的原理，主要开始前在反应体系中额外加入了特别的荧光物质，使得每轮扩增后特定DNA的实际数量都能够通过荧光的强度变化被检测出来。荧光的有无可以“实时”地反映样品中是否含有特定DNA；而荧光强度的变化情况则可以帮助对样品中的特定基因进行“定量”。

目标DNA片段本身是十分微小的，即便是通过大量扩增，所产生的荧光信号依然是十分微弱的，需要通过特别的光学系统进行检测。而针对这种弱光检测，数字PCR仪所配置的相机具有高灵敏度、高信噪比、高量子效率以及好的DSNU、PRNU，成为了决定检测结果可靠性的核心因素。

众相机：我们来了！

超高速大视野的新一代制冷背照式sCMOS相机Kinetix，帧速可达400fps，大靶面10MP/6.5μm，量子效率高达95%，三种读出模式：HDR、常规、高速。

▲超高速大视野背照式sCMOS相机—Kinetix

制冷型高灵敏 sCMOS相机pco.edge 26，可提供极低的读出噪声和暗电流，大靶面26MP/2.5μm，紧凑的外形设计，量子效率可达72 %。

▲制冷型高灵敏 sCMOS相机——pco.edge 26

非制冷大靶面sCMOS相机pco.panda 26，超高分辨率5120 x 5120，像元尺寸2.5μm，拥有真正电荷级的全局快门，极低的读出噪声和暗电流，超紧凑的体积，量子效率可达65 %。

▲非制冷大靶面sCMOS相机——pco.panda 26

紧凑型非制冷sCMOS相机pco.panda4.2系列，前照式、背照式可选， 2048×2048分辨率，像元尺寸6.5μm，帧速40fps，超紧凑的外形设计65×65×65mm，适合短时间曝光的低照度应用，前照式80%QE、2.1e-读出噪声；背照式95%QE、1.8e-读出噪声。