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数字PCR在病毒临床检测中的应用

2021.7.02

概述

2015年刚成历史，2016年已在眼前。就这样，年复一年间沧海成桑田。生命科学领域，新方法层出不穷，老方法不断升级，好不热闹。也如孔子的感叹：逝者如斯夫，不舍昼夜。

就拿PCR技术来说，荧光定量PCR作为一种进行基因表达分析的技术，截至目前最大的应用市场是病原微生物的核酸体外诊断。展望未来，作为qPCR升级版的数字PCR，最大的应用市场必然将转变成肿瘤相关的液态活检，对此陈斯卡坚信不疑。

那么，数字PCR在病原微生物的核酸体外诊断方面，是否仍然存在机会？是否在某些方面具有更出色的表现？对于《Lennette's Laboratory Diagnosis of Viral Infections第四版》的编辑Keith R. Jerome而言，答案是肯定的。2013年1月他就撰文，显然看好数字PCR在病毒检测中的应用前景，但2013年年初时，来自学术界一线的数据还较少，所以那篇综述可以理解为仅仅是他个人的看好。

一年后，在学术界源源不断的数据产出下，Keith R. Jerome（他任职于Fred Hutchinson Cancer Research Center的疫苗和传染病研究部门）结合自己的研究数据，于2014年5月撰文论述了数字PCR在病毒临床检测上的应用前景。本期，我们以他的观点为代表，阐述数字PCR在病原微生物（不仅限于病毒）核酸分析中的优势及应用的可能性。

qPCR面临的问题

虽然荧光定量PCR是目前病毒分子检测方面的“金标准”，具有广泛的应用，但由于对核酸分子的定量是依赖Ct值进行计算得到的，因此qPCR的最大瓶颈在于需要依赖于标准曲线。而构成标准曲线的标准品本身又缺乏统一的计量标准，因为标准品本身就是已知浓度或含量的样品。这两方面的因素造成了qPCR定量的结果在实验室内部与实验室之间的偏差（intra-和inter-laboratory imprecision），甚至不同实验室得到的结果是矛盾的。

数字PCR基于单分子层面的计数，可以彻底摆脱对标准品的依赖，解决由此而引起的结果重复性差的问题，大大提高检测结果的精度。

dPCR在精度方面的优势

对于qPCR而言，尤其当病毒处于低丰度水平的情况下，检测结果的精度往往不理想。即使对于那些很有经验的实验室，有时结果的CV值（coefficient of variation）在20~30%之间，甚至更高。

截至目前，造成这种偏差的原因不明，对于CMV（巨细胞病毒）和HIV的研究表明，病毒载量的微小上升在临床上也具有显著意义。Waggoner对22例CMV感染患者的检测显示，病毒水平从200 copies/ml以下增加到200 copies/ml以上，患者就会出现明显的症状。这种情况下，检测结果的精度对于临床治疗尤其重要。精度越高，越能排除检测技术本身导至的偏差，结果越能反应患者在不同的检测时间（日或周）病毒水平的差异。如果病毒载量的对数差在50%以下， qPCR技术就不能实现有效区分。

由于数字PCR绝对定量的特点，在相同TaqMan检测体系下，能显著降低结果的CV值。例如，Strain对150例HIV感染患者pol基因和2-LTR环状DNA的检测表明，pol基因ddPCR结果的CV值比qPCR下降了4倍，2-LTR环状DNA ddPCR结果的CV值下降了20倍（ddPCR和qPCR对每个样品进行3次平行检测）。即使对高水平CMV（大于10,000）的对比实验显示，ddPCR结果的CV值也低于qPCR。本综述作者所在实验室对不同浓度CMV的测试也得到相同的结论。

ddPCR对结果精度的提升还体现在“比例测试”的检测上，例如对以染色体重组整合方式存在的HHV-6（人类疱疹病毒6型）检测。人群中约1%的HHV-6病毒通过与人染色体着丝粒区域重组的方式存在，这种情况下qPCR不能区分HHV-6急性感染和ciHHV-6潜伏感染。ddPCR采用双重探针检测，可分别检测HHV-6的保守区域与宿主细胞的内参基因，最终通过HHV-6/cell的数值来判断患者是否是ciHHV-6潜伏感染。对经FISH验证的ciHHV-6感染患者淋巴细胞的检测发现，上述比值的平均值为0.96，SD值为0.03，CV值仅为3%。

dPCR可助力分子检测的标准化

qPCR进行病毒检测其结果在实验室之间可比性较差，究其原因在于“标准品”没有统一的标准。世界卫生组织（WHO）专门制备了“标准品”供全球的实验室使用，目前对“标准品”的定标采用对不同实验室的结果取平均得到。最近National Institute for Standards and Technology采用数字PCR的方法对CMV（SRM 2366）进行定标（CMV也是第一个采用数字PCR来进行定标的病毒），由于对该标准品给出了绝对的拷贝数，所以能用于实验室之间的校正、方法学的验证、不同assay结果的比较等等。

dPCR对抑制剂更高的耐受度

本综述作者专门设计了对比实验，系统比较了ddPCR和传统定量PCR对SDS、EDTA、Heparin（肝素，血液抗凝剂）等常见临床样品中PCR抑制物的耐受程度。通过比较两种平台的抑制曲线和最大抑制浓度中值（IC50）表明，ddPCR对SDS、肝素的耐受度高于荧光定量PCR。ddPCR的这一特性使得该技术尤其适合于复杂临床样品的检测，如粪便、痰液和组织样品等等。

为什么ddPCR能更加耐受PCR抑制剂的机制还处于进一步研究中，可能的原因有二：1，因为ddPCR在反应终点对荧光信号进行检测，所以对PCR扩增效率的要求大大降低，而荧光定量PCR则要求assay的扩增效率必须在90~110%之间；2，ddPCR的微滴化过程将PCR抑制剂排除在PCR反应液的水相环境之外，从而提高了对抑制剂的耐受度。

原文阅读
Tanis C. Dingle, Ruth Hall Sedlak, Linda Cook, Keith R. Jerome. Tolerance of Droplet-Digital PCR vs Real-Time Quantitative PCR to Inhibitory Substances. Clinical Chemistry 59:11 （2013）

dPCR目前存在的问题

数字PCR毕竟是一种比较新的技术，综述作者认为5年内还不可能取代荧光定量PCR方法大规模用于临床上对病毒的分子检测。
目前来看相较于qPCR，数字PCR的通量及单个样品检测的成本还不具优势。
数字PCR的自动化程度还不能和荧光定量PCR处于同一水平。
同样的条件下，数字PCR检测的线性范围不及荧光定量PCR。
相比于荧光定量PCR，在检测的灵敏度方面数字PCR并未表现出优势。（关于这点，已有很多研究显示出数字PCR在灵敏度上的优势，后续会专门就这个问题进行介绍）

dPCR的两种实现方式

目前已经面市的商业化数字PCR设备通过2种方式来实现：芯片式（以Life Technologies和Fluidigm为代表）和微滴式（以Bio-Rad和RainDance为代表）。从检测成本看，目前Bio-Rad的ddPCR最低。此外，Bio-Rad也已经实现了最大96个样品的自动化微滴制备和检测。