活体动物体内光学成像（六）
17. 标记好的细胞的荧光素酶是随机还是插入固定的位点？ 插入的位点是随机的，但每一个构建好的细胞株我们都做过详细的分析，与其母细胞株进行详细的比较，证明荧光素酶的插入对细胞的各种特性(包括生长周期, 成瘤性等)没有造成影响。
18. 能标记病毒吗？能标记病毒的某一个基因吗？ 可以标记病毒，由于病毒在核酸结构上的特性，每个病毒标记的方法不一样，具体的可以参见有关文献。还没有看到标记病毒某一个基因的报道， 但理论上讲，将荧光素酶基因与想标记的基因平行表达，可以标记任何基因。
19.
细菌标记问题 对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。
利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。已经标记好了几十种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，在这方面很有经验。具体标记情况请与我们直接联系。
关于仪器的特性等问题
20. 为何活体成像技术能看到体内发出的可见光？
两个主要原因使可见光成像技术能够看到体内发出的微弱的可见光。一是高灵敏度的制冷CCD镜头，可达到零下-105°C，使体内发出的非常少的光子也能够检测到。
二是绝对密封的暗箱装置，可以屏蔽包括宇宙射线在内的所有光线。
21. 正常成体小鼠可以看到体内发光吗？ 是否不需要裸鼠？
可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同，我们的技术可以看到成体正常老鼠的体内发光。这正是这项技术的价值所在。可见光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作为活体成像的动物，
并有很多关于大鼠的文章。
22. 能检测在组织内部的发光吗？光能透过肌肤多深？ 可以。若有发光足够强的标记细胞，在老鼠体内任何一个地方都能看到约一立方毫米的细胞瘤(约106细胞)。穿透性可达到3-4CM (小鼠身体厚度约7-8 CM)。
23.
仪器灵敏度如何？ 仪器对发光细胞检测的灵敏度与细胞发光的强度有关。在标记细胞活跃发光的情况下，
仪器可以检测到最少100个皮下接种的发光细胞。若细胞在体内位置深(如原位种植)，比如内脏，最少能检测到的细胞数目需要多一些。一般每增加0.5cm可检测到的最少细胞数增加一个数量级。具体评论见BLOOD
2003 年的一篇文章： “the sensitivity of cell detection in vivo is surprisingly
high and exceeds even the sensitivity of detection by flow cytometry ex
vivo. As few as 7x103 cells are detectable in the lungs early after
injection, 2-2.5x104 cells within liver or spleen, and as few as 1x104
tumor cells within the BM of a femur give rise to a sufficient signal to
be detected externally. In other experiments using cells with even
higher luciferase expression, as few as 100 cells can be reliably
detected in the peritoneal cavity of living animals. BLOOD, 2003, V.101,
pp640-8
24. 能检测分散在各处的单个细胞吗? 可以检测到流体的细胞，只要细胞总数达到100以上。许多文章，其中用荧光素酶标记了T细胞, NK细胞, 造血干细胞和其他淋巴细胞。在这些标记的细胞总数达到一百以上时，我们的仪器可以观察到信号（见上篇关于T细胞的索引）。
25.
活体成像技术如何定量分析？
活体可见光成像技术采取绝对光子数的计算方法，记录单位时间内、单位面积、单位角度接受到的光子数。这样，不同时间、不同仪器的测量结果可以进行比较，具有绝对的定量意义。每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验，其中包括在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线。
26. 不同的组织对光的吸收程度不一样，不同的组织之间能进行定量研究吗？ 不能。目前的文献都是同样的组织比较，进行同样组织的前后不同时间的定量分析。
27.
荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比？ 是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点,
包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。密西根大学Brian
Ross发表的一篇文章专门研究了这个问题。确定荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9 以上。
28.
仪器的解析度如何？分辨率如何？
仪器的最高解析度在0.1毫米左右。由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光图片不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。小动物CT和MRI，在这方面具有优势，因为放射线走的路线很直。
29.
能定位在哪个脏器吗？凭什么？当进行肿瘤转移研究的实验时，在观察期间，不杀死动物，如何判断某一部位发光是由于皮肤、皮下组织，肌肉，脏器还是骨骼的肿瘤转移造成的发光？特别是对于一些较小的脏器，如淋巴结转移。
此技术无法直接定位标记细胞和基因所在的组织和器官。但是实验人员凭经验，可以靠发光细胞在老鼠的身体位置推断标记细胞或基因所在的脏器。若需要证实,
还需要将老鼠解剖，进行体外检测。
30. 拍摄普通照片的和生物发光照片的是一个CCD镜头吗? 是, 只不过爆光时间和快门不一样。
31. 镜头那么低温度，动物不会冻死吗？ 低温只是在CCD镜头的小环境内。其它范围内都是室温。
32. 使用麻醉机相对于腹腔注射麻醉有什么优点？ 麻醉系统可以对小鼠的麻醉情况包括时间，程度等有更精确的控制。使用起来也会更加方便。
33. 荧光配件相对于其他公司的荧光的优势在哪里？ 相对宽的应用范围，可以观察波长在400-900nm的荧光，因此适用于GFP及各种荧光染料的标记。还有一套12张专门的滤光片用来消除非特异性的背景光。并且其成像速度快，适合大批量的实验。
