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活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用六

2020.6.29

（二）荧光成像技术优点

在活体动物可见光成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：

1. 荧光染料、蛋白标记能力强

荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时，不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记，同时成像。检测的波长范围从300~1100nm，某些仪器公司还提供全光谱的滤光片实现几乎所有荧光标记的体内成像。

2. 信号强度大

由于荧光是在外界光源激发下产生的能量转移现象，其光子强度较其它光学信号更强，持续时间长，信号所反应的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低，仪器不需要必须配备低温冷CCD（如绝对温度＜-80^oC），节省实验成本和购置成本。

3. 实验成本低

相对于活体生物发光成像来说，荧光成像费用低廉，无需注射底物荧光素。荧光发光基团只要在其合适强度的激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反应不需要向动物注射任何昂贵的反应成分，只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。

4. 活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像

由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像。而对于生物发光，只有在活细胞内才会产生发光现象。

总之，生物发光和荧光技术，如何互为补充，取长补短，分别满足不同的研究领域，将来的发展方向是两种技术并重。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法（表11-1）。

表11-1 生物发光及荧光特点的比较

优点

缺点

生物发光

特异性强，无自发荧光

高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞

检测的深度在3-4厘米

精确定量

信号较弱，检测时间较长，需要灵敏的CCD镜头，仪器精密度要求高；

需要注入荧光素，实验成本高；

细胞或基因需要转基因标记；

有些物质不能用生物发光标记，如抗体、多肽等

很难用于人体。

荧光

荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白及染料可用于多重标记；

信号强度大，成像速度快；

实验成本低；

活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像；

可衔接体内实验和体外实验，保持研究的连贯性；

未来可能用于人体。

非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约10⁵细胞；

检测深度受限制；

较难精确体内定量。

四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程

（一） 仪器原理

以NightOWL ⅡLB 983为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由CCD配合密闭性非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方，动物平台（可加热，以保持观察实验动物的体温）位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。

选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长450-700nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人员经过探索发现，背照射背部薄化冷CCD是唯一合适的选择。这种CCD芯片温度可达<-80⁰C，在该温度下，芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从3.5厘米到25厘米的连续视野。

成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的光污染。

在荧光配件的设计方面，光源采用75W的钨卤灯，该系统首先实现了荧光激发光源能量从0%-100%可调节，并通过光导纤维反馈控制激发能量在检测时间内保持稳定，有利于定量的准确性。另外，还通过采用均匀照射的激发装置、窄波带的滤光片等保证荧光成像能较好的去除背景噪音的影响，获得清晰的检测结果，较准确的定量数据。

为了对实验动物进行可见光成像，需要将实验动物进行麻醉，以获得期望的观察角度及稳定的数据。对于生物发光成像来说，由于检测的时间较长，一般建议使用气体麻醉。气体麻醉系统组成包括：气体蒸发器、诱导麻醉箱、流量调节阀、单独控制开关的五通道小鼠麻醉室、废气吸收装置等组成。在成像前，将实验动物置入诱导麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱进行观察

软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距、CCD的升降、曝光时间、滤光片的更换和照明灯的开启等，具有友好的用户界面，操作简便。

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