活体动物体内光学成像（七）
关于生物发光与荧光及其它技术的比较
34. 荧光检测与生物发光检测的优势与劣势比较如何？ 荧光发光需要激发光，但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发, 它是以酶和底物的特异作用而发光, 且动物体自身不会发光，这样生物发光就具有极低的背景。虽然荧光信号远远强于生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。另外，生物发光信号可以用于精确定量。因为荧光酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。 即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，光在体内路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度，光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。 因为这些原因，目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。 但是，荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和简单的动物体内研究方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点（表1）以及实验要求，选择合适的方法。
表1 生物发光及荧光特点的比较
优 点 | 缺 点 | |
生物发光 | 高灵敏度 | 信号较弱, 需要灵敏的CCD镜头 |
荧光 | 多种蛋白及染料可用于 | 非特异性荧光限制了灵敏度 |
35. 为什么用荧光素酶, 而不是用绿色荧光蛋白来检测体内发光? 一方面是荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。另一方面, 荧光 素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强。这样一来，得到的信噪比很高。而荧光蛋白需要激发光来产生反射光。老鼠的毛皮、肌肤以及一些食物都会产生非特异性荧光，造成很强的非特异性背景光，得到的信噪比很小。虽然荧光蛋白的发光强度很高，大量应用于体外检测；但荧光酶标记的方法更适合于体内检测。荧光酶体内检测的灵敏度要比荧光蛋白在体内的灵敏度至少高三个数量级(1000倍)。
36. 发光的波长与体内的穿透性如何关系？ 荧光素酶发出的光主要是偏红光，与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同。荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。
37. 相对于传统技术，生物发光成像技术的优势在哪些研究领域？ 该技术是一项在某些领域有很大不可替代优势的技术，但是并不是万能的技术。与传统技术相比，肿瘤转移研究，基因治疗，流行病学的发病学研究，干细胞示踪，白血病的相关研究等是该技术非常有优势的领域。在药物开发方面，用该技术进行肿瘤的药效研究，比传统方法更灵敏，还可以通过一系列转基因疾病动物模型，来快速直观的进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。
38. 生物发光成像不能标记的领域？ 小分子药物，多肽等。这些方法现今为止的最好的标记方法还是以放射性标记。
39. 生物发光成像和小动物CT比较有什么特点和优势？ 小动物CT的基本原理是利用X射线成像，通过对所观察对象的密度变化，进行动物内部结构方面的研究。他的优点是分辨率高，不需标记。缺点是特异性差， 在肿瘤很小时无法区分肿瘤细胞和正常细胞，并且对于肿瘤细胞的活跃程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇关于乳腺癌骨转移的文章里，详细比较了小动物CT与生物发光成像在肿瘤转移方面的灵敏度。小动物CT要在接种16天以后，成瘤很明显后才能够观察到骨转移的存在。而生物发光成像在接种后当天就可以实时观察到癌细胞的转移和走向。并且，小动物CT需要对动物有较强的X-射线照射， 容易引起突变，对动物的生理有一定影响。
40. 小分子药物的标记用荧光与PET，哪一个更好？ 如果用荧光蛋白，可以标记细胞或病毒。 如果使用合适的荧光小分子， 如Cyt5.5等，可以标记蛋白例如抗体等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子药物等，只能用放射性同位素标记， 用PET或SPECT的方法进行研究。 因为即使荧光基团如Cyt5.5也会影响小分子药物的药理药效和代谢活动。
41. 体内可见光技术和其它体内成像技术(PET, CT, 及MRI)的比较 简单优点：适用于小动物的研究，灵敏度高，特异性好，操作简单，无放射性，价钱便宜。缺点：无法标记小分子药物，暂不适用于人类和临床(正在研究中)，分辨率低，体内精确定位有限。
