如何控制糖基化提高蛋白质药物产品质量
蛋白质药物研究者表示，大多数畅销的生物制剂和大约一半批准的治疗性蛋白质药物均含有糖基结构成分。这些糖修饰在生物药物的功能，稳定性和效力中起重要作用。因此，糖基化是许多生物药物的关键质量属性（CQA）。最近，在细胞培养和发酵过程中控制糖基化一直是一项具有挑战性的研究。
对代谢途径的更多了解允许更有效的过程优化，高通量分析方法的发展也促进了这一研究过程的优化。在某些情况下，细胞系工程改造能够得到所需糖基化行为的细胞。最近，已经引入了体外糖工程，作为将糖基化控制从生物反应器中的复杂条件转移到更简单的下游纯化加工的方法。
为什么要控制糖基化？糖基化的变化会影响治疗产品的安全性，功效和清除率。因此，蛋白质糖基化的控制在生物药物开发和生产中至关重要。
Roche国际产品经理Roland Dorn表示：“糖基化有可能成蛋白质药物成功进入市场的关键。”作为翻译后修饰的最常见形式，糖基化涉及糖与治疗性蛋白质骨架的连接。不同位置上不同糖的存在会影响蛋白质的折叠，稳定性和活性，例如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和药代动力学。例如，促红细胞生成素（EPO）的唾液酸化对于良好的药代动力学性质是非常重要的。
发酵过程中的糖基化会发生一定程度的异质性，并且会受到许多不同因素的影响，例如表达系统，培养条件，培养基成分和补料方案。因此，存在糖基化的类型可能因批次差异而存在一定的风险，从而导致产品质量的变化。因此，糖基化被认为是必须控制以确保良好蛋白质质量的CQA。
负责药物市场开发的科学家Michelle Yannetti认为，代谢研究和建模作用通过代谢途径对细胞中蛋白质进行翻译后修饰，我们可以识别正确的营养成分，从而有助于修改最终产品的质量参数。
为了支持质量源于设计（QbD）方法来优化糖基化过程，还开发了一些数学模型，这些模型结合了糖类生产的关键要素，例如高尔基体中的N端糖基化过程，细胞培养动力学和核苷酸糖的生物合成。研究人员补充说：“希望在将来，这样的模型将针对所需聚糖特征的生物过程设计和控制的优化，而无需大型实验程序。”我们也看到了越来越多的创新，特别是考虑到可用数据的数量大，因此开发出可以比当今使用的方法更快地预测所需过程和营养模式的模型。
糖基化分析能力的提高
早期考虑产品质量（特别是糖基化）的分析涉及到较长的样品处理，然后进行适当的色谱和质谱（MS）分析以确定目标蛋白的糖型分布。Yannetti解释说：“这个问题通常将蛋白质分析测试限制在最初的研究，然后在过程开发的最后才能给出更多的研究，而且实验结果通常从最初的产品直接转移到最后的研究结果，而对变化的原因知之甚少。”
分析和制剂开发总监Byron Kneller表示，在过去的五年中，检测蛋白质糖基化的分析能力得到了显着改善。他说：“对于某些分子，完整的蛋白质液相色谱-质谱法（LC-MS），无论有或没有进行一步蛋白质纯化，都具有足够的糖型分析分辨率，其结果可以做出工艺决定。”另外，现代的高分辨率质谱系统（四极杆飞行时间，Orbitrap）为蛋白质糖型提供了足够的分辨率，但是前提是异质性不高。
Kneller补充说，在糖型异质性高或需要更多细节的情况下，已发布的聚糖分析方法的通量已得到充分提高，可以在合理的时间内分析大量样品。Yannetti认为，这种方法已经可以更快地用于样品制备，而且甚至有高度灵敏，高通量的替代方法可以分析更多样品，从而可以在整个工艺开发过程中监控聚糖的变化。
对于单克隆抗体（mAbs），一种常规的分析方法是酶释放后的荧光标记聚糖使用超高压液相色谱（UHPLC）。据罗杰斯说，这种技术在生物仿制药领域具有重要的应用，人们将重点放在检测聚糖结构上微小差异的能力上。例如，有公司已开发出专有的染料，可用于轻松检测低摩尔浓度的标记聚糖，并正在开发具有更高灵敏度的其他染料。
罗杰斯（Rogers）同意质谱已成为许多分析方法应用的选择方法。他说：“该技术能够提供特性数据，而与聚糖类型无关，具有内在的敏感性，可适用于常规放行测试。”它也是能够揭示与蛋白质和聚糖有关的信息并允许无需结构修饰即可获得数据的少数方法之一。
Kneller认为，分流方法在某些情况下可能有效。通过这种方法，可以使用快速但分辨率较低的方法从许多少量潜在的有希望的工艺条件或单克隆，然后使用高分辨率方法重新分析这少量样品，以实现更可靠的结果。
罗杰斯说，细胞系工程和生物工艺设计方面的进展为依托的生物制剂的开发和生产，特别是mAb领域的开发和生产已取得了相当大的进步。由于对可影响糖基化的可控生物过程参数（例如补充剂浓度，pH值等，溶解氧，细胞系选择和温度）的可控制有了更深入的了解，这些特殊治疗剂的糖型已经从早期的相对多样的聚糖种群发展为简单，同质的结构，批次间差异很小。
糖基化抑制剂也已在生产过程中有效地用于操纵最终的糖基化产物。例如，在甘露糖苷酶II抑制剂作用情况下，可以选择性地产生具有杂合聚糖结构的糖蛋白。
Mark Rice表示，复杂的单克隆筛选，培养基优化以及在过程开发过程中使用复杂的按比例缩小模型会用于研究大规模过程，这些过程在糖基化方面非常适用于生产和上游发酵工艺开发。他说：“从亲本细胞系中选择具有良好糖模式的单克隆要比使用基础和补料培养基，补充剂，水解产物添加和工艺变更更容易，也有更好的稳定性。”另外，在后一种情况下，CQA和效价之间通常存在令人不愉快的折衷。他观察到：“对细胞系进行工程改造以产生特定的聚糖具有广阔的前景，并且还提供了一种“即用型”解决方案，可节省大量开发时间。
另一方面，Yannetti则有不同的看法。“尽管有几个研究小组证明了能够改造细胞以消除不良糖型（例如，改造α-岩藻糖基化以增强ADCC活性）的能力，但最近对代谢途径以及营养物质和过程转换参数的影响的理解似乎提供了最大的优势她说：“这方面取得了进步，从而在蛋白质质量方面实现了更好的控制和一致性。”“如今，凭借我们在向培养物输送营养方面所获得的知识，有可能提供可预测糖基化的目标，并解决工艺和营养物输入均导致不理想的糖型变化。”
体外糖工程学看起来很有希望
罗氏诊断公司的科学家发现了一种将糖基化管理与复杂的细胞培养和发酵过程脱钩的方法。Roche Custom Biotech用于体外糖工程（IVGE）酶和活化糖的特性齐全，在下游加工过程中特异性和高效地改变糖的部分。产品组合中不含动物和抗生素的糖基转移酶已对多种糖蛋白表现出高活性。根据Dorn的说法，可以按克至千克的量提供它们，并在需要时符合GMP要求。
他断言：“从发酵中分离糖基化管理分离了优化糖基化和产量的策略，从而更好地控制了糖基化和产量。”他补充说，通过IVGE，可以使用具有明确动力学和可预测结果的离散酶反应，在下游加工过程中丰富某些糖型（例如半乳糖基化和唾液酸化），从而避免了对生物工艺过程进行不确定性调整的需要，从而避免了可能缩短的开发时间并改善了开发过程控制制造过程。
进行了广泛的研究以证明不同酶的性能。根据Dorn的研究结果证实，它们对许多不同抗体和其他靶蛋白的N-糖基化具有选择性。反应可以在不同的缓冲液中进行，但应考虑缓冲液的离子强度，因为它会影响酶的活性。在37摄氏度下孵育通常会在24小时或更短的时间内完成反应。酶的最佳浓度取决于靶蛋白的类型。
此外，根据Dorn的说法，可以在单罐反应中进行半乳糖基化，然后进行唾液酸化，而无需在第一步后纯化蛋白质，但是双重唾液酸化的程度略低于分别进行两个反应时的水平。其他研究表明，对来自蛋白A捕获色谱法是将IVGE纳入下游纯化过程的最简单方法。罗氏（Roche）目前正在开发一种残留酶测定法，该方法可用于确认蛋白质产品中不存在糖基转移酶。
最后，证明了IVGE可用于研究聚糖谱与受体结合行为之间的相关性。目前，Dorn还指出，没有迹象表明IVGE处理会导致蛋白质的微观异质性发生任何实质性变化。
需要做更多的工作，但进展显着。十年前，我们很高兴改变凝胶上的电荷分布。如今，由于我们对糖型的了解及其与观察到的药代动力学（PK）的复杂性急剧增长，因此我们的标准是最大程度地提高与良好PK相关的和体内观察到的特定聚糖形式。他补充说，由于采用了更好的设备和用于单克隆评估的分析，从而提高了通量，从而能够更早，更好地筛选并避免出现问题的细胞系，以及在此过程的后期解决糖基化问题的需要。
鉴于这种成功的生物API类的生物工艺优化和糖基化控制的重点，因此该知识很大程度上与mAb的N-连接聚糖有关。罗杰斯指出，其他类型的糖基化，例如O型连接和C型连接结构，在某些潜在的治疗生物制剂中也很重要，但其生物合成途径与产生N型连接结构的途径截然不同，尚未受到关注。在生物过程控制方面进行同样的调查。因此，他认为，未来对糖基化过程的更多了解和控制可能会影响其他疗法的生产，例如病毒疫苗，其中糖蛋白的外层可能会对通过聚糖结构介导的免疫原性产生显着影响。
根据Yannetti的观点，当今最大的需求是创新公司确定哪种聚糖形式最适合不同治疗应用中的蛋白质。她说：“一旦有了明确的目标，就有可能从开发开始就进一步完善选择，以控制聚糖谱，甚至可能在稳定的克隆选择和开发水平上，以适应平台流程。”
同时，Rogers期望随着对特定糖型结构和功能的理解的提高，未来的技术很可能会通过细胞系选择和特定过程控制应用来分离或生产单个所需糖型。他说：“当然，蛋白质工程将继续允许操纵糖基化位点的数量和位置，从而增强某些特性，例如效力和半衰期，这已经用EPO实现了。”
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