ADC 单抗药物的分子量、氨基酸序列、糖基化位点以...（二）

2020.5.18

2.1.3 数据分析方法

采用 Protein Deconvolution 2.0 软件对原始质谱图进行去卷积处理，得到完整的蛋白质分子量信息。

2.2 氨基酸序列、糖基化位点和 ADC 药物结合位点测定

2.2.1 仪器和试剂

质谱仪器：Q-Exactive（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Thermo Scientific, C18, 100Å ,1.9 μm, 2.1×100 mm

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。

2.2.2 仪器方法

色谱分析条件：具体见表 3；

表 3. 氨基酸序列测定的色谱分析条件

流动相	A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	300 μL/min
柱温	35℃
色谱梯度	时间/min	B相浓度/%
	0	5
	4	5
	45	35
	50	90
	52	90
	52.5	5
	60	5

质谱分析条件：具体见表 4；

表 4. 氨基酸序列测定的质谱分析条件

喷雾电压	3.5 kV
毛细管加热温度	275℃
S-lens	60 %;
碰撞能量	27% 归一化能量
碎裂方式	HCD
质量扫描范围	m/z 300–1800
分辨率	一级35,000（m/z 200）,
二级17,500（m/z 200）

2.2.3 数据分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）、赖氨酸（K）ADC结合（+956.3644Da）、天冬酰胺（N）G0F糖基化（+1444.5300Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。

3. 结果与讨论

3.1 蛋白质分子量测定

基于高分辨质谱 Q-Exactive，为了保证采集谱图的质量和数量，我们设定 Orbitrap 检测器的采集分辨率为 17,500。经过 Q-Exactive 质谱采集的 ADC 单抗药物的原始色谱质谱总离子流图和原始质谱图如图 2 和 3 所示，我们可以观察到 ADC 抗体药物在整个质量范围内表现出均匀的电荷分布，不同电荷的质谱峰之间可以实现基线分离，从而可以判断质谱的灵敏度、分辨率和信噪比都很高。同时选取强度较高的几组质谱峰进行放大，放大之后的几组质谱峰显示相似的分布模式。