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乳糜微粒的检查过程

2022.3.12

  1、免疫透射比浊法:

  (1)标本应是及时分离的空腹血清,可密封存放在2~6℃冰箱中,1周内测定,-20℃可存放半年。

  (2)用全自动分析仪时,应根据不同仪器设计参数,合理选择抗原抗体比例及反应时间。也可作速率法散射比浊测定CM如用Beckman比浊仪ICS或protein array system)。

  (3)手工法所用仪器:精密光度计,具有340nm滤光片(或分光器),样品池体积以0.5ml为宜(为节省抗血清),最好用流动杯,样品稀释最好用稀释器、经校正的加样器。

  (4)标本处理:将血清标本及质控血清各用样品稀释剂作1:200稀释,即先作1:20稀释(5.Oμl血清+95μl稀释剂)后,再作1:10稀释(多余的1:20血清作测定apoB用)。

  混匀后,25~37℃放置30min,在波长340nm比浊,根据U-UB的A值,在标准曲线上读出结果。

  本法批间CV<5%。

  (5)校准曲线:在手工与半自动操作中每批测定均需作校准曲线,可将校准血清稀释成1:100、1:200、1:300和1:400等4种浓度,与标本同样操作,根据定值计算出每个标准管CM浓度,以浓度(X)与其相应的A值(Y)作图(用直线回归计算),基本上成直线,但在Y轴上有一定截距,所以不能用单点标准。操作准确时浓度与A值的相关系数应在0.985以上。

  如有高、中、低浓度的三份校准血清时,可与标本同样操作,做三点定标,也可作五点定标(即高、中浓度的血清等量混合,及中、低浓度的血清等量混合,成为另两份校准血清)。

  本法线性范围:0.4~2.5g/L。

  2、火箭电泳法:

  (1)浇板:每板用10g/L琼脂糖10ml,沸水浴中融化,混匀,冷至50~55℃时加入CM抗血清50μl,apoB抗血清8μl(用量视抗血清效价而定),迅速混匀后倒在预置在水平台上的玻璃板上,冷后放在4℃,20min后打孔,孔在板的阴极端,孔径3mm,孔间距至少5mm,孔容量5μl。把板放入电泳槽,用滤纸搭桥。

  (2)稀释抗原:用0.15mol/L NaCl液将校准血清稀释成1:100,1:150,1:200,1:300,及1:400(作校准曲线之用),血清标本按1:200稀释,放4℃冰箱不得超过3天。

  (3)加样:在低电流状态(10mA/板)将稀释好的定值血清及标本分别吸取5μl(准确),加入琼脂糖凝胶加样孔内。每板都要做一系列标准。

  (4)通电:稳流24mA/板,端电压6~8V/cm,以流水冷却使琼脂糖保持15℃,电泳3~4h。

  (5)脱杂蛋白及制干胶膜:电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min,将胶膜托置于聚酯薄膜上,用多层滤纸在轻轻加压下吸干胶内水分,然后将滤纸、胶膜与聚酯膜三者一起自然干燥,或用热吹风器吹干,干后胶膜会自然与滤纸及聚酯膜分开。

  (6)染色:将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20~30min。

  (7)脱色:用脱色液浸泡已染色的胶膜至火箭峰清晰,背景基本无色。可在水中用两片玻璃纸将胶膜夹住,晾干后可长期保存。也可以用流水浸泡脱色至背景干净。

  附注:

  ①抗原稀释倍数与抗血清用量的选择,应以火箭峰清晰、校准曲线斜率适中并成直线为宜。本法同时测定apoA-Ⅰ与apoB,应调整两种抗血清用量,使二者峰高有区别,apoB峰高不小于1cm。

  ②不同种类来源的抗血清(如兔与羊),在等效价的情况下进行试验,结果会有差异。apoA-Ⅰ测定以兔抗血清为好。用兔血清时峰形尖细,而羊血清所产生的峰粗,峰尖圆钝,有时在峰顶前出现虚影。校准血清所作校准曲线斜率也不同。但不论用何种抗血清,定量结果差别不大。

  ③在一定条件下电泳,不同稀释度校准血清的峰高不会有明显变动,校准曲线斜率基本一致。如标本峰高超出校准曲线范围时,应调整标本稀释倍数后重测。板间CV通常小于5%。

  ④火箭电泳结果可以用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰。前者用标本少,节省抗血清,但如适当增加标本及抗血清用量,不染色更为方便。所用琼脂糖应为标准电渗或低电渗的,凝胶中加入适量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。

  ⑤火箭峰的测量可以计算面积或峰高,面积是峰高乘以峰宽(峰半高处的宽度)。测量精度最好能达0.1mm。须用机械或电子放大设备。标准曲线范围内峰高以1~4cm为宜。

  ⑥本法适用于少量标本分析。也适用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)测定。

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