淋巴细胞转化形态学检查法
实验概要
本实验对淋巴细胞的转化进行了形态学检查。
主要试剂
1. 植物血凝素 目前国内已有成品出售(广州医药工业研究所)，可根据需要，作适当稀释后使用。一般为每毫升培养液加入PHA 50~75μg。也可自制，即从广东食用红肾豆(鸡子豆)或东北菜豆中提取，经效价滴定后，按每毫升培养液加入0.1ml含50单位的PHA，相当于Difco PHAM 50μg。
2. 营养液配制 通常采用199营养液或RPMI1640作为培养液。取199培养液79ml，依次加入小牛血清20ml，“双抗”1ml，再用经过高压灭菌的56%碳酸氢钠调整pH值至7.4左右，每小瓶分装25ml备用。除上述营养液外，也可应用41营养液(上海生化所东风厂生产)、0.5%乳白蛋白水解物或Eagle氏液。
3. 肝素、小牛血清、双抗。
4. 生理盐水、0.87% NH4Cl溶液、瑞氏染液等。
实验步骤
操作方法：
1. PHA加入营养液取盛有25ml营养液的培养小瓶1支，加入PHA，最终含量为50～70μg/ml营养液。
2. 采血、培养无菌抽取被检动物血0.5ml，注入含有PHA营养液小瓶内，混匀后，置37℃温箱培养3～4天，每天摇动1～2次。
3. 溶解红细胞第三天(或第四天)吸弃上清液，加入37℃预温的0.87% NH4Cl溶液3ml，置37℃温箱孵育15min，然后加满生理盐水。
4. 离心混合后，以1000 r/min离心10min。
5. 弃去上清液，将沉淀物推片，瑞氏染液染色1~2min。
6. 镜检计数用油浸镜，从左到右从上到下，观察200个淋巴细胞，将淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞换算成百分率。
结果分析：
1. 转化淋巴细胞的形态特征
1) 转化淋巴母细胞体积增大，约大于原成熟的淋巴细胞3倍。
2) 细胞核的核膜清晰，核内染色质疏松呈网状结构，可见1～3个核仁，有的核呈分裂相。
3) 胞浆丰富，呈嗜碱性染色，核周围的胞浆有一染色较浅的透明区，为伪足状突起，胞浆内有小空泡出现。
2. 转化率观察200个淋巴细胞，并按下列公式计算：
转化率=过渡型 母细胞淋巴细胞总数×100%
正常情况下转化率为60%～80%。
注意事项
1. 严格的无菌操作是淋巴细胞转化试验成败的关键。
2. 营养液的酸碱度与转化试验有很大关系，以pH值7.4为宜，偏酸条件下细胞发育不良，容易破碎，偏碱条件下，细胞有收缩倾向。培养瓶的塞子要塞紧，以防漏气而使pH值发生改变。
3. PHA量对试验结果有一定影响，过低或过高时均可使转化率降低，因此需要预先滴定PHA效价，以每毫升培养液加入50u为宜。广东医药工业研究所生产的PHA，不同批号效价稍有差异，一般为每毫升培养液含50～75μg。
4. 实验条件尽可能保持相对稳定，更换主要材料(如培养液、小牛血清、PHA液)后，应作正常对照。
5. 推片不均，染色不佳，均会影响结果和计数。由于母细胞多聚集在推片的尾部，故计数时，要求在尾部与体部交界处观察，或将推片头、体尾不断移动计数。
