聚酰胺部分水解后固定化酶到氨基实验
基本方案
| 实验方法原理 |
聚酰胺的部分水解是酶固定的一种简单的方法，然而，必须注意避免聚酰胺结构的大量分解。固定的反应有 4 步： 1. 聚合体材料的蚀刻法用于增加表面区域和亲水性； 2. 氨基的部分分裂； 3. 自由氨基或羧基的活化； 4. 酶结合到有活性的聚合物上。 |
|---|---|
| 实验材料 | 酶溶液 |
| 试剂、试剂盒 | 硼酸盐缓冲液 甲醇 戊二醛 CaCl2 HCl 磷酸钾 NaCl |
| 仪器、耗材 | 长颈瓶 旋转蒸发器 吸滤器 |
| 实验步骤 |
1. 聚胺的蚀刻 合成聚酰胺外套的小片（如 2 cm2，10 片）被浸没在 250 ml 圆底的长颈瓶中，长颈瓶中装有 18.6％（质量分数）CaCl2 和 18.6％（质量分数）甲醇的混合物。长颈瓶用旋转蒸发器 50℃ 旋转 20 min（无需真空）。然后，将小片在吸滤器或玻璃料上用水充分冲洗。 2. 氨基化合物的部分裂解 2.1 水解分裂。聚酰胺小片浸没在 3.65 mol/L 盐酸中用旋转蒸发器 50℃ 旋转 40 min （无真空）。其后该小片在吸滤器或玻璃料上用水充分冲洗，最终用 0.2 mol/L pH 8.5 的硼酸盐缓冲液冲洗。 2.2 非水解分裂。聚酰胺小片浸在甲醇中，在 25 ml N，N-二甲基-1，3-丙烷二胺中 70℃ 孵化 12 h 之后，干燥聚酰胺小片。氨基在吸滤器或玻璃料上用水冲洗除去。 3. 自由氨基的活化 经水解分裂、非水解分裂或置换之后的聚酰胺小片放在 25 ml 溶有 50 g/l 戊二醛的 0.2 mol/L pH 8.5 磷酸盐缓冲液的圆底长颈玻璃瓶中（无真空），在旋转蒸发器中 20℃ 旋转 15 min。过量的戊二醛在吸滤器或玻璃料上用 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾充分冲洗除去。 4. 酶结合到活性聚酰胺。 在冲洗聚酰胺小片之后，马上添加酶溶液（0.2～0.5 mg/ml 溶于 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾，小片必须完全沉浸在溶液中）在 4℃ 孵化 3 h。在玻璃料上用溶有 0.5 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾冲洗，除掉没有被固定的酶。其后，用 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾冲洗来降低髙盐的浓度。如果短期储存，固定了酶的小片保存在 4℃ pH 7.5 的 0.1 mol/L 磷酸钾中。如果长期储存，这些小片迅速用水冲和用空气干燥（这个过程对于很敏感的酶是不能承受的）。
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| 注意事项 | |
| 其他 |
1. 材料 酶溶液（0.5 mg/ml 酶溶于 0.1 mol/L 磷酸钾，pH 7.5） 2. 试剂 0.2 mol/L 硼酸盐（硼酸/硼酸钠）缓冲液，pH 8.5 甲醇 50 g/L 戊二醛 CaCl2 3.65 mol/L HCl N，N-二甲基-1，3-丙烷二胺 0.1 mol/L 磷酸钾，pH 7.5 0.5 mol/L NaCl 溶于 0.1 mol/L 磷酸钾，pH 7.5
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