荧光定量PCR实验指南-5
您可以选择荧光染料SYBGREEN体系，具体请参照说明书。
您可灵活使用20-50ul间其他体积，注意保证终浓度相同。
A2010A0106试剂盒:
反应体系终浓度(自配热启动荧光系统)：
1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+
、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer（A2010A0106）；50－900nM的上游引物（可先设200nM）、
50－900nM的下游引物（可先设200nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板,无菌去离子水补足，反应总体积通常为 20－50ul
自配热启动荧光－UNG体系：
1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、
2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0105）；0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先设为
0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP（要调整）(A2010A0108)；50－900nM的上游引物（可先设200nM）、50－900nM的下游引物（可先设200nM）、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul。
3、反应体系和条件的优化:
使用高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start），优化参数最少。您只需要优化退火温度，就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。对于特殊结构的荧光PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。
使用通用PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制，可以适合更多的反应体系，如mRNA的普通RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCR，同时也适用于荧光PCR，范围更宽。
采用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，该试剂盒中含有进行热启动荧光核心试剂盒的所有成分，也降低了选择纯度不够或不合适产品的风险。您需要根据以下原则进行优化：
1、您需要对酶量和镁离子浓度进行优化。酶的推荐反应浓度为1.25－1.5 U（50ul），必要时可在1-2U之间探讨酶的最佳条件；Mg离子推荐浓度普通PCR终浓度为1－3 mM, 荧光PCR终浓度为3－5.5 mM，请在该范围内探讨最佳条件。
2、试剂盒中提供的dNTP已经预混，能够充分保证产品质量和PCR的忠实性。dNTP选择经典的0.2mM的浓度即可。
3、另外，上游引物和下游引物浓度可先设为200 nM。当结果不理想时，可以在50nM－900nM之间进行探讨。
4、 如选用Taqman探针，探针浓度可设为200 nM，不须探讨。选择其他种类的探针需根据要求设置探针浓度。
5、可以先用推荐的反应条件，如果结果不佳，可根据引物、探针设计的具体情况适合的退火温度，退火时间和循环数。
6、DNA模板的添加量通常在100
ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step
RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
7、稀释所有探针、引物或配制模板请使用无菌双蒸水或Tris溶液。所有反应容器应保证无菌无酶无热源。如进行RNA反应应采用无RNA降解酶的水和容器进行操作。
如采用hot start
Taq酶来配制与A2010A0101相同的热启动荧光体系（含UNG/dUTP防污染体系），您可以选择A2010A0105，A2010A0107和
A2010A0108进行。与A2010A0106不同的是除了以上的优化步骤外，还增加了对UNG/dUTP系统进行探讨。建议先使用
A2010A0106优化好产品体系后，再来优化该防污染系统。
0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先设为0.5U）、 0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP
(A2010A0108)。反应条件如酶量、Mg离子等都已经调好（参照A2010A0106）,您可以固定d(A,C,G)TPs的浓度为0.2mM，并设定UNG浓度为0.5U(50ul)，dUTP浓度也设为0.2mM，初步来看反应结果。如结果不理想可调整dUTP浓度（上调）。直至得到满意结果。并可进行防污染能力测试（用含U的扩增片断进行）。
请参照3：影响PCR及荧光PCR 的其他因素进行优化。总之，优化的指标越多，实验的不确定性就越大。避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性。可参照的QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事项。
4、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析；
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Applied Biosystems)；MX4000
(Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ
Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线
