Nature Methods：单细胞RNA-seq方法的比较
随着大家对单细胞转录组分析的兴趣日益增加，开展单细胞RNA-seq的方法也在不断涌现。近日，斯坦福大学的研究人员比较了市场上各种单细胞RNA扩增方法，以系统评估单细胞RNA-seq方法的灵敏度和准确性。他们的研究结果发表在《Nature Methods》在线版上。
目前，整个转录组的高通量测序(RNA-seq)已广泛用于各种组织的基因表达分析。然而，人们开展单细胞转录组分析的愿望也越来越强烈，这是因为有些细胞量少珍贵，不足以开展传统的RNA-seq，也有人希望对异质群体中的细胞亚群开展分析。过去的基因表达“平均值”已不再能满足人们的需求。
近年来，开展单细胞RNA-seq的各种方法时有报道，但关于这些方法的通量和性能还存在一些问题。比如说，性能主要是通过灵敏度和精确性来评估的。然而，为了评估测定方法的有效性，还应当评估准确性，即测量值与真实值之间有多接近。
为此，斯坦福大学生物工程系的Stephen R Quake领导的研究小组对102个人类单细胞转录组进行了定量的RNA-seq分析。他们采用了三种单细胞RNA扩增方法，分别为SMARTer Ultra Low RNA Kit(Clontech)、TransPlex Kit(Sigma-Aldrich)以及利用C1微流体系统(Fluidigm)进行SMARTer cDNA合成。同时，他们也利用大量总RNA开展传统的RNA-seq，并通过多重qPCR对同一细胞类型中的40个基因进行独立定量，来评估单细胞方法的准确性。
由于很难获得绝对表达水平，研究人员计算了每种细胞的相对表达水平，即相对所有转录本中位数表达的基因表达。所产生的无量纲数应独立于测定方法，可直接比较，以确定方法的准确性。他们发现，对于单细胞方法，qPCR和RNA-seq的表达值相关性良好(r > 0.84)，证实了单细胞RNA-seq方法能够以定量的方式检测基因表达，与目前的金标准qPCR方法一致。
有趣的是，各种方法之间的相关系数和线性回归的斜率不同。相关系数表示每种方法能够在多大程度上再现 qPCR所测定的表达，而斜率表示一些失真。他们发现，以纳升体积开展样品制备(C1系统)产生了几乎为1的回归斜率，表明绝对准确性最高。一种可能的解释是，减小反应室的体积可增大反应物的有效浓度，减少模板与非特异分子之间的竞争，从而减少扩增偏向。
此外，研究人员还直接比较了微升和纳升级的样品制备，发现对于qPCR和RNA-seq，以纳升体积制备的样品都产生了更少的假阳性。作者认为，与管式的样品制备相比，C1平台表现出一些优势，包括假阳性低和偏向小。
作者总结道，他们的结果表明，单细胞RNA-seq可产生与qPCR相当的结果，特别是在以纳升反应体积制备样品时(如微流体装置C1)。通常在样品制备过程中引入的偏向减小，而相关性也进一步提高。他们希望，低偏向、高通量的单细胞RNA-seq将让原代组织的研究变得常规。
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