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使用合成核苷酸作探针实验——在绿化四甲胺中(TMAC)杂交

2019.3.26
实验材料

寡核苷酸

试剂、试剂盒

LBSDSEDTATMAC

仪器、耗材

水浴锅离心机培养箱尼龙膜

实验步骤

1.  按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”介绍的方法处理已影印细菌菌落的滤膜。

2.  按下列方法制备带扩增噬斑的滤膜

(1)从文库中以渐减密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板)的方式将噬菌体铺在琼脂糖平板上。

(2)37 ℃培养至长出可见的噬斑。

(3)将噬斑影印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜后,滤膜移至预热的LB琼脂糖平板上,37℃培 养5~12 h(转印后冷室保存主平板)。

(4)将影印到膜上的噬菌体DNA变性并使之结合到滤膜上。

 

3.  转印细菌菌落的滤膜按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”的步骤1洗膜,然后将滤膜浸入50℃ 2×SSC / 0.5%SDS / 50 mmol/l EDTA,pH8.0溶液中洗涤,尽可能冼去滤膜上影印的细菌残渣,然后用同洋的溶液再洗1遍。

 

4.  按每张滤膜5~10 ml 预温的TMAC杂交液量,在15 cm 玻璃水晶盘中可移入多达30 张的滤膜,用塑料保鲜膜将玻璃盘封好。

5.  在杂交温度下预杂交1 ~2 h。杂交温度和洗膜温度均应比解链温度低5~10℃。

 

6.  预杂交后,将滤膜转移到一个装满新鲜、预热的TMAC杂交液的杂交容器中。

7.  并按毎毫升杂交液加入1×106~2×106 cpm35P标记的寡核苷酸探针,于适当的温度下温育40~60 h。

 

8.  室温下每张滤膜先用5~10 ml TMAC洗液洗涤,然后分别将滤膜转移到200~ 250 ml 新鲜的TMAC洗液中,轻轻振荡洗涤15 min。

 

9.  换上等体枳预热的TMAC冼膜液,在适当的洗膜温度下温育1 h。

10.  再用等体积的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室温下洗膜,共3次,每次约10 min,以去除TMAC。

11.  最后按在氯化钠/柠檬酸钠中杂交”进行放射自显影。
 


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