细胞形态观察（电镜检测）活率测定（亚细胞结构分离）
一、实验内容
1、细胞电子显微镜检测
2、细胞活率测定
3、亚细胞结构的分离与鉴定
二、实验设计
前一天细胞传代:
1. （电镜）中午每班传细胞入含小盖片培养瓶3瓶
晚上1瓶正常、2瓶损伤
次日损伤2瓶中，其中1瓶损伤恢复
2. （活率）中午每组传细胞入96孔培养板9孔
晚上3孔正常、6孔损伤加无糖培养液
次日损伤6孔中，其中3孔损伤恢复
3. （分离）每组传代细胞（1传2）25ml培养瓶2瓶
三、操作
（一）电镜标本制备、送检、观察比对正常、损伤及损伤后恢复标本、照相、分析、总结
（二）细胞活率测定――MTT比色法
实验步骤：
1、接种1.5×104/ml细胞于96孔板、每孔加200ul培养液 37℃、5%CO2、饱和湿度下培养；
2、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养液180ul 、再加 MTT溶液20ul，继续培养；
3、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO溶液150ul，振荡1分钟；
4、酶标仪492nm波长处比色。
结果观察及要求：
1、活细胞被染成深蓝色，而死细胞不被染色
2、记录酶标仪上光吸收值，记录结果
3、分析每组细胞生长情况
注意事项：
1、吸弃和添加培养液时要注意，尽量不要将细胞吹起;
2、每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml ，避免影响实验的区分度；
3、高浓度血清会导致实验本底增高，比色前尽量使血清浓度不超过10%。
（三）亚细胞结构的分离与鉴定（细胞核的提取）
操作：
收集细胞（消化法）—— 离心(1000/min×5’ ) ——沉淀加0.075M KCl
4ml，吹打，静置20min——离心(1500/min×10’ ) —— 取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀——离心（2500/min×10’）
——取沉淀加少量固定液涂片——酒精灯烤干——甲醇固定5 ’——Giemsa染色5
’——自来水冲洗——吸水纸吸干玻片（反面）——显微镜下观察（鉴定）
结果：
细胞核染成深兰色
注意事项
1、注意正确使用离心机（平衡、对称）
2、正确使用显微镜
3、Gimsa工作液临用前稀释
（PBS：Gimsa原液9：1）
