酶免疫检测技术在食品检测中的应用
(1)抗球蛋白抗体的制备:
欲检动物的同种健康者 IgG 的提取:用3%～50%的饱和硫酸铵盐析法分离健康动物血清中的 IgG,通过透析和葡聚糖凝胶电泳等方法纯化(简称X IgG)。
制取异种动物(简称Y)抗X IgG抗体:用 X IgG 对 Y 进行数次免疫后,提取 Y 抗 X IgG 抗体,并使其纯化。
(2)酶标记:用高碘酸钠法对 Y 抗 X IgG 抗体进行辣根过氧化物酶标记。
(3)抗原:
①寄生虫抗原标准性方面,应注意考虑:寄生虫的种、株及发育阶段,保虫宿主及体外培养的条件,感染至收虫的时间,分离方法,制备可溶性抗原的方法,质的控制等问题。
②提取抗原的方法有如下步骤:新鲜冷冻虫体磨成匀浆,用冷无水乙醇或丙酮、乙醚脱脂数次,以3℃ PBS 调pH 至7.0～7.4的三双馏水充分提取,亦可反复冻融或超声波处理,经透析或凝胶 G-25过滤除去小分子成分,以 DEAE 纤维素做梯度分离,冷冻干燥备用。
(4)抗体纯化方法同前。
(5)底物:辣根过氧化物酶的底物。
5-氨基水杨酸(5-AS):取 80mg 的 5-AS 溶于 1000mL 蒸馏水中,此液用前必须用 NaOH 调 pH 为6.0。
(6)固相载体:聚苯乙烯塑料管。聚苯乙烯微量血凝板8×12孔,计有96个 U 形或 V 形孔。
(7)反应实施:方法有间接法、双抗体法、竞争法。
测量抗体水平的程序一般为:抗原吸附于载体表面,洗涤3次,加被检血清,洗涤3次,加入酶标记结合物,洗涤和孵育,加底物,而后终止反应,最后判定结果(目测或分光光度计在 400nm 波段测定吸光值)。
以塑板载体间接法为例:试验前,将96个凹孔用抗原致敏,即每孔中滴 0.25mL 已用 pH 为9.5的碳酸盐缓冲液稀释的抗原,置4℃过夜,用含0.05%吐温和0.02%叠氮钠的 pH 7.4的 PBS 洗涤3次。于每孔中加 0.025mL 用PBS 吐温稀释的被检血清,振摇塑板后,室温2h,如上法洗涤3次,再加 0.25mL 底物溶液,室温30min,最后每孔加 NaOH 终止酶反应。反应结果为:阳性反应者为黄色,目测即可。
