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大肠杆菌杂交及基因定位实验

2019.8.09

一、原理

大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株（Hfr）的染色体上整合有F因子，当Hfr细菌与F^－细菌细胞发生接合（即杂交）时Hfr细胞（供体菌）的染色体从Hfr细胞向F^－细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据结合后F^－细菌（以重组子形式选出）中Hfr细菌染色体基因出现次数的多少，即可得知基因转移的先后顺序，也就是说基因在染色体上排列的顺序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入F^－细胞的机率大，重组频率高，远离转移起始点的基因进入F^－细胞的机会少，重组率低，F因子大部分位于转移起始点相对的一端（末端）。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足以使整个染色体转入F^－细胞（受体）时，才会使F^－细胞转变为Hfr或F^＋状态。

基因定位时首先要从Hfr与F^－细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F^－细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其它的Hfr基因（非选择标记）出现的次数。Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以100％的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于100％的频率出现在重组子中。F^－细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的F^－菌株为Str^r, Hfr菌为Str^s,借此可排除Hfr菌的生长。另一方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率，F^－细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F^－细菌接合（10～20：1）。

二、目的

通过本实验，了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。

三、材料、试剂与器具

1、受体菌：FD1004　F^－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT str^r rif^r。
2、供体菌：CSH60 Hfr sup str^s。
3、生理盐水：0.85%NaCl。
4、10×A缓中液。
5、基本培养基。
6、LB培养基。
7、选择培养基[B]—[G]：基本培养基加氨基酸（表1－2）。
8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。

四、操作步骤

1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和受体菌于5ml LB培养液中，37℃振荡培养10－12小时。
2、第二天清晨，各取1ml过夜培养物，分别加入到2个盛有5ml LB培养液的250ml三角瓶，37℃振荡培养2－3小时。
3、吸取0.5ml供体菌和4.5ml受体菌，加入到一个无菌的250ml三角瓶中混合，置37℃摇床上培养100分钟。
4、将上述接合菌液用生理盐水稀释10⁰、10^-1、10^-2倍。

5、各吸取0.1ml稀释液涂布在选择培养基[A]平板上，每一种稀释液涂布2个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂布在[A]上作对照，每种各2个平板。此后均于37℃条件下培养48小时。
6、第四天，1）观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状况；2）在与平皿相同大小的白纸上画100个小格，将圆片贴于选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A]平板上随机挑选100个菌落，对号点种在选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100个小格中；3）将所有平板置于37℃箱内培养48小时。
7、第六天，统计在各种选择平板上生长菌落的数目，记录。并绘制出基因顺序图。

选择性培养基附加成份表

培养基编号	选择性标记	基本碳源	基本培养基（A）中补充物质
培养基编号	选择性标记	基本碳源	str	rif	arg	ilv	met	leu	ade	trp	his
A	Met leu str	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
B	(met leu str)arg	葡萄糖	＋	－	－	＋	－	－	＋	＋	＋
C	(met leu str)trp	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	－	＋
D	(met leu str)his	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	－
E	(met leu str)lac	乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
F	(met leu str)gal	半乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
G	(met leu str)rif	葡萄糖	＋	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋

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大肠杆菌杂交及基因定位实验

周锦帆