免疫组化的操作流程
实验概要
本文介绍了免疫组织化学实验操作流程，主要有：脱蜡和水化，抗原修复及免疫组织化学染色等步骤。
实验原理
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
主要试剂
1. PBS缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml)：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
3. 0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5. 酶消化液：
1) 0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制；
2) 0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7. 封裱剂：
1) 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)等量混合；
2) 油和TBS(或PBS)配制。
8. TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
主要设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉
2. 水浴锅
实验步骤
1. 脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2) 无水乙醇中浸泡5分钟；
3) 95%乙醇中浸泡5分钟；
4) 70%乙醇中浸泡5分钟；
2. 抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1) 抗原热修复
a.
高压热修复在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b. 煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
c.
微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin
A，Cyclin，ER，Heat shock
protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。
2)
酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3. 免疫组织化学染色
SP法：
1) 脱蜡、水化；
2) PBS洗2～3次各5分钟；
3) 3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4) PBS洗2～3次各5分钟；
5) 抗原修复；
6) PBS洗2～3次各5分钟；
7) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8) 滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9) 4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10) PBS洗3次各5分钟；
11) 滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12) II抗中可加入0.05%的tween-20。
13) PBS洗3次各5分钟；
14) DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15) PBS或自来水冲洗10分钟；
16) 苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17) 自来水冲洗10～15分钟；
18) 脱水、透明、封片、镜检。
SABC法：
1) 脱蜡、水化。
2) PBS洗两次各5分钟。
3) 用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4) 抗原修复。
5) PBS洗5分钟。
6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
8) PBS洗三次每次2分钟。
9) 滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10) PBC洗3次每次2分钟。
11) 滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12) PBS洗4次每次5分钟。
13) DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14) 蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15) 脱水、透明、封片、镜检。
