激光共聚焦显微镜技术的应用
最近需要做成骨细胞培养的实验，师兄给个建议，说是可以做激光共聚焦显微镜 检测。关于这个我还真不知道该如何下手设计这个实验，网上搜集了一些资料，分享给大家，供参考。
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM )是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。它是在荧光 显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域。
一. 组成
倒置或直立荧光显微镜 、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备
二. 原理
Confocal
利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。
计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。
三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:
1.点照明
2.具有照明pinhole和探测pinhole
3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面
4.具有扫描系统―― 逐点扫描成像
5.具有多个(四个) 荧光通道，可同时探测多个被标记物
例如: Leica TCS NT 的技术指标:
1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x
传统显微镜: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 样品的最大厚度:大约 2mm(10X/0.2物镜)
取决于三点:
物镜的景深, 与NA成反比
Z轴的最大移动范围
激光的穿透力
3. 样品的最小光切厚度: 大约0.35 mm
取决于两点: 物镜的数值孔径NA
Z轴的最小移动步距: 40nm
Z轴的分辨率: 0.35 mm
4. 激光器
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar激光器(UV): 361nm
激光器的特点:
1) 方向性好: 激光基本眼直线传播
2) 单色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合
5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集
多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透
射光图像为非共焦图像
四. 共焦显微镜的类型：
1.点(慢)扫描共焦显微镜: 分辨率高, 图像清晰;
噪音低;
采集图像速度慢;
目镜中观察不到共焦图像;
2.线(狭缝)扫描共焦 显微镜(video rate): 分辨率低;
噪音高;
扫描速度快 240幅/秒;
目镜中可观察到共焦图像
3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜: 性能介于上述两者之间
功能:1.多荧光标记样品的图像采集
2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”
3.真正的三维重组
4.假三维图的显示
5.可沿Z轴(xy平面)和Y轴(xz平面)方向进行光切
6.定量分析
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 扫描―― 时间序列扫描
8.图像处理
9. 旋转扫描
10.区域扫描
11.光谱扫描
五、激光扫描共焦显微镜技术的应用
定位、定量
三维重组
动态测量
*活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量
*活细胞内H+浓度( pH值)的测量
*自由基的检测
*药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量
应用：细胞膜电位的测量
荧光漂白恢复(FRAP)的测量
笼锁解笼锁的测量
荧光能量共振转移(FRET)的测量
其他应用
1、定位、定量
免疫荧光标记(单标、双标或三 标)的定位、定量。如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位
细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
荧光原位杂交： 染色体基因定位
单细胞凝胶电泳
GFP的表达
游离Ca2+ 的分布与定量
定位、定量研究中常用荧光探针
1)Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等
2)FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3)异硫氰基荧光素 494/518
4)TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5)Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618
6)PE 藻红蛋白 565/578
7)cy3 490/530
8)cy5 650/690
(1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白
免役荧光标记： 与抗体耦联,
直标: 一抗+荧光探针
间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针 肌动蛋白 Palloidine+荧光探针
(2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)
标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC
2.标记细胞器荧光探针
(1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短
JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光
线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光
可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电
位最佳探针: Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,
稳定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞
(2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性
