分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

基因甲基化特异性PCR扩增（MSP）试剂盒使用说明

2020.5.11

主要用途

基因甲基化特异性PCR扩增（MSP）试剂盒是一种旨在通过设计符合胞嘧啶转化的特殊引物，对转化基因组的CpG岛区域进行PCR扩增，探测基因甲基化信息的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于父母印记、X染色体研究、肿瘤抑制基因等表观遗传学研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。

技术背景

在基因的启动子区域（promotor region）通常存在一些富含重复双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”（CpG island）。在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛。这些CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。

产品内容

扩增液（Reagent A） 900微升

补充液（Reagent B） 1毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

转化样品：经过亚硫酸盐转化的目标DNA分子

特异引物：用于甲基化基因扩增的引导DNA分子

PCR仪：用于样品扩增

PCR管或平板：用于PCR反应的容器

实验步骤

实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：

针对一个样本，每次移出15微升扩增液（Reagent A）到PCR管
加入1微升用户自备的的转化或野生型DNA样品（总量100纳克）
分别加入1微升用户自备的甲基化特异性的引物F和引物R（各350纳克或25微摩尔）
再加入7微升补充液（Reagent B）（反应总量为25微升）
即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
加入50微升PCR级矿物油（注意：参见注意事项10）
即刻进行热启动PCR反应：

温度（℃）	时间	循环
95	2分钟	1
95 Tm 72	30秒 90秒 30秒	35
72	5分钟	1

反应完毕后，移取5微升进行1.8%琼脂糖凝胶电泳或15%聚丙烯酰胺凝胶
如果进行测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒；20051.1）
分别移出2微升反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管（每微升100纳克）
加入1微升用户自备的甲基化特异性的巢式引物F（每微升350纳克）到其中一个1.5毫升离心管，作好标记
加入1微升用户自备的甲基化特异性的巢式引物R（每微升350纳克）到另一个1.5毫升离心管，作好标记
进行后续的直接测序反应

注意事项

本产品为60次操作
操作时，须戴手套
建议使用带滤芯的枪头，避免污染
转化后的DNA样本须保存在－20℃冰箱里，否则容易降解；同时尽快进行扩增等后续操作
一个特定基因的甲基化检测通常包括转化、PCR和直接测序三步。PCR用于筛选和定位，可以发现0.1%甲基化；测序是精确定位，是分析金标准
一个特定基因的甲基化特异性PCR通常包括三组PCR：野生型（W）、转化后甲基型（M）、转化后非甲基型（U）
甲基化特异性PCR的引物设计原则：引物以SENSE的DNA链为模板；引物含有足够多的C（后面不和G相连）；引物含有1－3个CpG位点；CpG位点须在3端；PCR片段长度在80－250碱基；三组引物取自同一位点，通过长度变化获得相同的Tm，并在电泳上有所区别。
直接测序的引物设计原则是：引物不能含有CpG位点；引物含有足够多的C（不和G相连）；采用巢式引物
基因甲基化区域选择原则：如果是一个首次检测的基因，首先，选择启动子部位；第二，选择足够多的CpG位点；第三、选择200碱基以上区域，且GC超过50%
通过1.8%琼脂糖凝胶或15%聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR扩增后的结果。假如DNA样品在修饰前是未甲基化的，那么仅仅“U”Primers将产生扩增产物；相反，已甲基化的DNA样品仅仅用“M”Primer能被扩增
组织样品或杂合子样品常常出现“U”和“M”同时呈现阳性；建议使用基因甲基化程度定量分析试剂盒（20024.3）予以分析
根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）
建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）
在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
本公司提供甲基化特异性引物设计服务
本公司同时提供数字化表观基因组完全分析（全部甲基化基因）技术试剂盒和外包服务（90002）
本公司提供系列甲基化分析试剂产品