包涵体（inclusion body）表达的蛋白的复性-2（二）
复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、 IMAC等。
当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。
复性时的蛋白浓度：
一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、 RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
几个复性的实例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性：10倍稀释到10mM
DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris
pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、 Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM
GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM
EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。
纯化：
一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。
