影响PCR的主要因素（温度循环参数、引物设计与DNA聚合...-2
1．Taq DNA聚合酶用Taq
DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是使PCR普及应用的关键。Klenow片段不能耐受95℃的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq
DNA聚合酶可以耐受93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR
的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：①Klenow酶的最适温度为37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。②循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1μg基因组DNA开始）而Taq酶为30个。③延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。
Taq酶由水栖高温菌（Thermus
aquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75℃。最初从中分离到分子量60～68KDa，比活性为2000～8000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary
Mullis等又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910。此种9.4KDa酶的最适温度为75～80℃，与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70℃时
Kact>60nt/s；55℃可达24nt/s；37℃时为1.5nt/s，而22℃时低至0.25nt/s。高于90℃时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。
在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5℃,95℃及97.5℃保持其50%活力的时间分别为
130、40及5～6min，在50次循环的PCR中当管内最高温度为95℃。每循环为20s时尚可保持65%活力。Taq
酶在95℃的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95℃。
Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli
Taq（Cetus公司）。Taq酶的完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有
38%是一致的，包括对dNTP结合，引物与模板作用区均存在于Taq酶中。
Taq酶具有依赖DNA合成的5’→’3’外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3’-磷酸化的“阻断物”，会被逐个切除而不会阻止来自上游引物链的延伸，而对于5’-32P标记的合成寡核苷酸引物，则无论是单链或是与模板复性，都未发现降解，所以该种活性不会影响PCR结果。Taq酶没有3’→’5’外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶没有校正能力，因此运用Taq酶进行PCR，产物中点突变较多，对克隆等不太有利。一般错掺率为1.25×10-4~1×10-5(4×dNTPs浓度分别为
200μmol/L，Mg2+为1.5mmol/L，在55℃退火)。但不含3’→5’外切酶活性对测序有利。
2．影响酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+离子的影响。用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2+为2.0mmol/L时激活能力最高。浓度超过此值产生抑制。
10mmol/l
MgCl2抑制活力达40%～50%。dNTP能与Mg2+结合，故游离Mg2+只是结合后剩余的量。若总dNTP浓度高至4～6mmol/L时,Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）。
表22-3 有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响
| 物质 | 浓度 | 活力（%） |
| 乙醇 | <3% | 100 |
| 10% | 110 | |
| 尿素 | <0.5mol/L | 100 |
| 1.0mol/L | 118 | |
| 1.5mol/L | 107 | |
| DMSO | <1% | 100 |
| 10% | 53 | |
| 20% | 11 | |
| 二甲基甲酰胺 | <5% | 100 |
| 10% | 82 | |
| 20% | 17 | |
| 甲酰胺 | <10% | 100 |
| 15% | 86 | |
| 20% | 39 | |
| SDS | 0.001% | 105 |
|
0.01% |
10 |
|
|
0.1% |
<0.1% |
用鲱精DNA，70℃，10min内dNTP的掺入量计算，标准条件为100%。
纯9.4KDa Taq酶不含3’→5’核酸外切酶活力。误掺入率取决于dNTP浓度。但Taq酶具有DNA依赖的链移位5’→3’核酸外切酶活力。对5’→3’32P 标记寡核苷酸单链，或与MB模板杂交时均只有极少的降解力。
中等浓度KCl能刺激Taq酶合成活力达50%～60%，最佳KCl浓度为50mmol/L，浓度更高有抑制作用，>200mmol/L的KCl可使酶失活。
加入50mmol/L NH4Cl或NH4Ac或 NaCl,可产生中度抑制或无作用。
低浓度尿素、DMSO、DMF或甲酰胺影响不大，吐温20/NP40可消除SDS（0.01%及 0.1%）的抑制作用。
3．第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel将Taq
DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5℃的半衰期从Taq
DNA聚合酶的5～6min提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合PCR（Multiplex PCR）更为有利。
VentTM DNA多聚酶：是美国New England
Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98℃中的Thermococcus
litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较Taq
DNA聚合酶更为优越，它能耐100℃高温且2h以上仍有活力，并且具有3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比Taq酶降低一倍。后来该公司又从深水潜艇（2010m）排气孔分离的能在104℃生长的Pyococcus菌GB-D株植入Deep
Vent DNA聚合酶基因而表达的Deep Vent DNA聚合酶，在95℃的半寿期达23h（Vent酶为6.7h,Taq酶为
