时间分辩荧光技术在乙型肝炎血清学标志物临床检验中...
时间分辩荧光技术在乙型肝炎血清学标志物临床检验中的意义
慢性乙型病毒性肝炎（ Chronic Viral Hepatitis B,CH-B ）是一种严重危害人类健康的疾病，我国是病毒性肝炎的高发区，乙型肝炎病毒（ HBV ）感染率高达 57.63% ，即全国至少有 6 亿人感染过 HBV 。现在乙肝病人达 2700 万，且每年新发病例近 1000 万， HbsAg 阳性率 9.75% ，约有 1.2 亿人，占全球的 1/3 ，其中约 1/4 将发展为慢性肝病，部分患者可发展为肝硬化，甚至演变为肝癌。据统计每年有 23.7 万人死于乙型肝炎相关的疾病，其中有 15.6 万人死于肝癌。大概有 5%-10% 的成年人和 70%-90% 的婴儿受感染后未能完全清除病毒而成为长期带病毒者，同时亦成为传播根源。
乙型肝炎血清学标志物为检测乙肝病毒感染的最主要病原标志和直接证据之一。乙肝病毒感染后病毒分泌的蛋白释放进入血液导致相应的抗体产生，病毒的抗原抗体共有三个系统，但因核心抗原在血清中一般不易检出，故俗称 " 两对半 " 或乙肝五项：即表面抗原（ HBsAg ）、表面抗体（ HBsAb ）、 e 抗原（ HBeAg ）、 e 抗体（ HBeAb ）及核心抗体（ HBcAb ）。在病毒感染缓解和愈合的不同时期，可有不同的存在模式。常见模式乙肝五项指标的临床意义如下：
表一 常见模式乙肝五项的临床意义
除上述常见模式外，还存在一些非常规模式，包括
HBsAg 与 HBsAb 同时存在的模式。 ( 只在现在 HbsAg 1 μ g / L 以下的人群中 ) 推测二者同存的原因可能是 HBV
发生变异引起 [2] ； 近年来亦有发现 HBeAg 可以与 HBeAb 共存的模式，在慢性乙型肝炎伴活动期肝损伤时，几乎 100% 为
HbeAg 、 HBeAb 共存。因之，对乙肝血清标志物的测定对临床有着极其重要的价值。
近年来医学临床和预防的要求对低水平存在的血清学标志物进行有效检测，具有更重要的临床和流行病学意义。研究证实，在部分
HBV
感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏检。尤其是目前普遍采用的酶标检测方法，对低水平人群更容易造成漏检。在较大范围的非肝炎患者住院人群的检测结果表明，血清
HBsAg 约在 5 μ g/L 以下者占总人群的 2.34% ；占 HBsAg 阳性人群的 23.16% ，其中， HBsAg 浓度在 1 μ
g/L 以下的占多数（ 44.40% ） [2] 。多方面研究表明，低水平血清 HBsAg
人群占有不小的比例，尤其我国是乙肝的高发区，加之人口众多，此类人群不容忽视。由于检查方法上的不灵敏，还可导致乙肝病毒通过手术，输血等途径发生传播等严重后果。因此，进一步提高血清
HBsAg 检测的灵敏度有重要意义。
目前，临床检测中乙型肝炎病毒（ HBV ）感染者的血清学标志物乙肝五项的检测主要有酶标方法，它成本低廉、操作简单、易于大批量检测，因此得到普遍应用，但它特异性和敏感度都较差，特别是重复性差（如孔间差异、批间差异、不同操作者之间差异、放置时间差异、环境温度不同等），而且由于方法学本身的局限性，酶标检测只能提供阴、阳性判断，不能提供 HBV 血清学标志物的具体含量，因此不能在病毒性肝炎临床诊断、疗效观察及疫苗注射后抗体含量多少及其动态变化方面进行监测，无法有效地动态观察病情和考核疗效，以及精确地了解免疫状况，为临床所能提供的信息有限；同时，对于低水平存在的血清标志物，酶标法检测易产生假阳性或假阴性的结果；因此，临床上也迫切要求自动化程度高，更加敏感和特异的方法。以往我们都推崇美国雅培公司的产品为准，但其价格较高，还不能作为常规推广。
近年来标记免疫分析法自动化发展迅速，主要有化学发光免疫分析法（ CLIA ）、电化学发光免疫分析法（ ECLIA ）和时间分辨荧光免疫分析法（ TRFIA ）等多种。在这几种方法中，由于 TRFIA 不受样品的自然荧光干扰，具有灵敏度高、特异性强、标准曲线范围宽、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短和应用范围广泛等优点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法。
下面简单介绍时间分辨荧光分析（ Time-resolved Fluorescence Immunoassay TRFIA ）的基本原理和应用技术。
TRFIA 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如铕（ Eu3+ ）、铽（ Te3+ ）及钐（ Sm3+ ）、镝（ De3+ ）等代替传统的荧光物质、放射性同位素、酶和化学发光物质，来标记抗体、抗原、多肽、激素、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如抗原抗体免疫反应、生物素（链）亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。
运用稀土离子及其螯合剂作为标记物，被激发的荧光有以下特点：
一、
与普通的荧光比较，稀土离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的 103 ～ 106
倍。从而可以通过延缓测量时间，让短寿命荧光衰变掉后，再测量目标样品，这样可以最大限度地克服来自样品、试剂的自然本底短寿命荧光（通常为 120nS
）及散射光的干扰，大大提高检测的灵敏度。
二、 激发光与发射光的 Stokes 位移大，可以达到 200 多 nm ，而普通荧光物质的 Stokes 位移最多也只有几十纳米。这表明，在某一波长测定样品荧光时，可以通过非常简单的方法（如使用滤波片或分光计），就可消除激发光和散射光的干扰；同时，被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，极大地降低了来自背景的各种干扰。
三、 标记物为原子标记，体积很小，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，这既保证了被检物质的稳定性（尤其对蛋白质影响更小），又可实现多位点标记。标记物稳定，就可以对标记物进行多次激发，通过对每次激发的荧光信号累加后（如激发测量 1000 次）取平均值的办法，可以大大减少偶然误差的产生，提高检测的准确度；同时多位点标记技术，不仅使检测更灵敏，也可使用双标记技术使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。
TRFIA 技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点，成为继放射免疫分析之后，标记免疫分析法发展的一个新的里程碑，被称之为 " 零本底 " 的检测方法。其灵敏度大大地超过了放射性同位素（如表 2 所示），是目前配基结合分析中最有发展前途的一项生化超微量检测手段，非常适用于生物学、医学上的超微量分析。
表 2 时间分辨荧光与放射免疫及酶联免疫方法学的比较
运用 TRFIA 对乙肝五项进行定量检测极大地弥补了酶标法定性检测的不足，成为乙型肝炎血清学标志物现代临床检验的发展方向，新波公司为此研制了 HBV 的 TRFIA 试剂盒，并获得国家批准文号，这是一个可喜的成果，它将推动我国乙肝防治工作和进展，同时亦将推动 TRFIA 技术的普遍应用。 TRFIA 在 HBV 感染诊断及免疫力监测方面的定量检测具有如下优越性：
1 ． TRFIA 极大地提高了检测灵敏度，检测 HBsAg 灵敏度可达 0.2 μ g/L ，而酶标法检测 HBsAg 灵敏度 2 μ g/L ，即血清中 HBsAg 达到 2 μ g/L 酶标检测才表现为阳性。因此， TRFIA 在急性乙肝早期能及早检出 HBsAg ，确证 HBV 感染，几乎能与 perS1 同时检出，在病程观察中大大缩短 " 窗口期 " 时间，而酶标法在乙肝是上期检测 HBsAg 常呈阴性；在慢性乙肝中，一些患者由于机体缺乏对 HBV 包膜蛋白的免疫应答， HBsAg 表达较低，酶标法检测可出现 HBsAg 和 HBsAb 均阴性的情况，而 TRFIA 可避免此情况，为正确判断病情提供依据；病毒发生变异后，表达量较低，常规酶标法测不出抗原，而 TRFIA 定量由于具有极高的灵敏度，可发生并极可能同时检测出 HBsAg 和 HBsAb ；此外，通过 TRFIA 定量检测可发现低浓度 HBsAg 携带者，如医护工作者、病人家属等由于长期密切接触而非血液直接传播的感染者，可密切关注并采取措施防止发展成为乙肝或慢性携带者。
2 ． TRFIA 定量检测可动态观察疗效并对病情进行检测，能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据，同时可以指导疗效：
1 ） 定量分析 HBsAg 和抗 -Hbs 的浓度变化，可以预见急性乙肝是否恢复期；
2 ） 定量分析 HBsAg 和抗 -Hbe 的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果；
3 ） 定量检测抗 -Hbc 浓度的高低可以反映病毒感染的状态；
4 ） 定量检测有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断。
3 ． 对 HBsAb 的定量测定 能够对抗体是否真正具有 " 中和 "HBV 的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监测作用。 HBsAb 的含量在 10mlU/ml 以上病人在用酶标检测就可呈 " 阳性 " 结果，但并不揭示机体部一定具有免疫力，而 HBsAb 的含量在 10-100mlU/ml 之间的样品，定性虽为 " 阳性 " ，但此时机体对 HBV 的免疫力较弱，甚至不能预防 HBV 感染，仍有感染 HBV 的危险。据相关报道，只有 HBsAb 的含量达到 100mlU/ml 以上时才可确定具有抵抗 HBV 入侵的作用。 HBsAb 的含量越高，机体抵抗 HBV 入侵的能力越强，持续保护时间越长。因此，经过定量检测，根据 HBsAb 的含量才能判断机体对 HBV 免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。如 HBsAb 的含量较低，应该加强注射一针乙肝疫苗，使 HBsAb 的浓度提高起到预防作用。
新波公司为了验证 TRFIA 试剂盒的可靠性，曾与雅培公司优良产品作了比照，其结果见表 3 ，提示了其检测结果的可靠性。
表 3 乙肝三系五项时间分辨荧光与雅培化学发光法标本对照
* HbcAb 因 TRFIA 血清作 1 ： 30 稀释；雅培化学发光法为原倍血清，结果缺乏可比性。
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