酶标仪在植物领域的三种应用总结
一、简介
在基于哺乳动物细胞的研究中，酶标仪主要应用于: (1) 常规分子检测，如核酸、蛋白浓度及酶活性分析等；(2) 信号转导研究， 如一些细胞信号事件如 ROS，修饰的检测；(3) 整体细胞水平的分析，如细胞的活力、凋亡和杀伤等。然而在植物领域中，酶标 仪的应用则偏向前两个方向，此外，植物领域的酶标仪应用普遍度也不及动物，但这并不限制酶标仪在该领域的应用前景。在此， 我们结合常见的应用案例介绍酶标仪在植物领域中的应用，提升酶标仪在植物研究中的应用价值，并进一步协助植物的科研发展。
二、利用酶标仪进行常见的分子检测和分析
在植物领域中一些基础的分子检测，如基于紫外吸收或荧光的 DNA，RNA 和蛋白定量及纯度分析等，都可以用酶标仪进行 高通量检测。由于原理和应用类型与研究哺乳动物细胞类似，在此就不赘述了，大家有需求可参考我们针对核酸定量的应用材料。 在此我们主要列植物领域中比较特色的几个案例。
2.1 吸收峰和荧光光谱分析
植物领域中通常会涉及到对一些感兴趣的化合物，如色素等的物理指标分析，其中就包括吸收峰分析和针对具有荧光特质的 化合物进行荧光光谱分析。通常这些分析会由分光光度计完成，但会受到通量和曲线分析能力的限制。现阶段大部分 Molecular Devices 推出的配备光栅的酶标仪如 M 系列和 iD 系列都支持出色的光谱扫描分析，包括全波长光吸收和荧光光谱扫描，步进可精 确至 1 nm，可应对常见的光谱分析需求，并极大提高通量。同时配备的 SoftMax Pro 软件可自动分析光谱图简化处理流程。
基于光谱扫描还可用于进一步分析具有调节荧光能力的蛋白功能，如蓝藻细菌中的 Orange Carotenoid Protein (OCP) 在强 蓝-绿光下会和藻胆 ( 蛋白 ) 体 (PBS) 相互作用来保护细胞。实验中可观察到 OCP 的引入可降低 PBS 的荧光发射强度。对于新发现 的 OCP 家族成员，我们就可以通过荧光光谱扫描功能确认其是否会淬灭 PBS 的荧光 ( 图一 )。结果发现相较于已知的 OCP1，新 发现的 OCP2 具有较弱的荧光淬灭能力 ( 图一，来源于文献 Nat Plants. 2017 Jul 10；3:17089. )。
图一 分析 OCP 的 PBS 荧光淬灭能力，黑色实线代表无强蓝-绿光照射下 PBS 的荧光发射谱 ( 激发 580 nm )，黑色虚线代 表在强蓝-绿光照射下 PBS 的荧光发射谱。蓝色和红色虚线分别代表在在强蓝-绿光引入 OCP1 和 OCP2 。 图片来源于文献：Nat Plants. 2017 Jul 10；3:17089.。酶标仪为 SpectraMax M2。
2.2 酶活分析
在植物研究中，酶活分析也是常见的检测之一，主要用于探究植物本身酶的功能和植物提取物对各种酶活性的影响。基于底 物工作机制的不同，酶活可用光吸收法和荧光法检测。例如图二就展示了多种植物的提取物对参与血糖调控的 α-淀粉酶 (α-amylase) 和 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 活力的抑制 ( 来源于文献：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12；60(36):8924-9.)。其中，α-淀粉酶 的活力检测是基于使用自身淬灭的 DQ™ starch 荧光底物。随着底物在酶的作用下发生降解，进而发出荧光，并可通过荧光强度 的变化分析酶活。而 α-葡萄糖苷酶活性的检测则基于其底物光吸收属性在酶处理下的变化。
图二 不同浓度植物提取物对 α-淀粉酶 ( 左 ) 和 α-葡萄糖苷酶 ( 右 ) 活力的抑制。图片来源于文献：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12；60(36):8924-9.。酶标仪为 SpectraMax Gemini ( 荧光检测 ) 和 SpectraMax 190 ( 光吸收检测 )
通常，酶活检测基于动力学检测模式，同时需要进行控温。多数 Molecular Devices 推出的酶标仪均可完成酶活检测。除此 之外，配备的 SoftMax Pro 软件支持工作流，可进行复杂的酶活设定和检测，同时对动力学的多种分析，如斜率，最高速度，曲 线下面积等，都可轻松用软件批量分析。
2.3 DPPH 和 ORAC 分析
DPPH 和 ORAC 分析是抗氧化研究中常见的两个检测项目，常被用于分析植物和中药提取物的抗氧化能力。其中 DPPH ( 1,1二苯基-2-三硝基苯肼 )自由基清除实验基于带有自由基的 DPPH 和中和后的 DPPH 具有不同的光吸收属性进行分析待测物质是否 具有自由基清除能力 ( 图三 )。
图三 DPPH 工作原理，图片来源于网址：https://www.omicsonline.org/articles-images/2161-0444-4-517-g001.html
因此，配备光吸收功能的酶标仪就可用于检测 517 nm 附近的吸收强度变化，进而推测待测样本的自由基清除能力。图四展 示了不同的类胡萝卜素的抗氧化能力比较 (Sci Rep. 2016 Feb 23；6:21987.)。
图四 基于 DPPH 自由基清除实验比较不同类胡萝卜素的抗氧化能力， 图片来源于文献：Sci Rep. 2016 Feb 23；6:21987.。酶标仪为 SpectraMax Plus384。
ORAC 实验则是检测氧化自由基吸收能力 (Oxygen Radical Absorbance Capacity)，与 DPPH 不同，其基于荧光法。体系中 引入的自由基产生者 AAPH (2,2’-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride) 会破坏荧光探针，使荧光强度逐渐衰退。而引 入的具有抗氧化能力的待测样本则会抑制荧光强度的衰退，进而通过计算荧光动态曲线的曲线下面积 (AUC) 的变化可分析待测化 合物的抗氧化能力 ( 图五 )。一般，ORAC 实验中会用 Trolox 标准品作为校准，获得不同待测样本的抗氧化指数 ( 图五， Molecules. 2013 Oct 17；18(10):12937-50. )。
图五 利用 ORAC 实验分析不同草药提取物的抗氧化能力。左图为荧光动力学曲线，可观察到草药提取物的引入增加 了荧光探针的信号寿命 ( 曲线下面积 )。右图为参考 Trolox 结果得出抗氧化指数。图片来源于文献：Molecules. 2013 Oct 17；18(10):12937-50.。酶标仪为 SpectraMax Gemini
三、利用酶标仪进行植物信号分析
除了一些常见分子的分析和定量之外，常见的植物信号，如报告基因、蛋白蛋白相互作用和 ROS 分析等，也都可以用酶标仪 进行高通量的分析。
3.1 报告基因分析
基于 β-葡萄苷酸酶 (β-glucuronidase) 的 GUS报告基因系统利用了在高等植物中 β-glucuronidase 表达和活性很低，是常见 的研究植物基因功能和活力的分析方法。基于不同的底物，GUS 报告基因可用多种方法学进行检测，包括组织染色法、光吸收法 和荧光法。在此主要介绍可用于荧光酶标仪分析的荧光法，其主要基于底物 MUG (4-methylumbelliferyl b-D-glucuronide)，其 在 GUS 的作用下产生具有荧光的 4-MU (4-methylumbelliferone)，可以进一步用荧光酶标仪进行分析。在进行荧光法 GUS 报告 基因检测时，通常需要 4-MU 标准品进行校准，同时 GUS 的活性还需要进一步使用总蛋白量来校准。此外，4-MU 本身容易降解， 因此使用时注意保护和有效期。
荧光法 GUS 报告基因系统在植物研究中的应用方向很多，其中包括特定的基因启动子活力在激素处理和压力情况下的变化 ( 图六，J Exp Bot. 2005 Mar；56(413):909-20. ) 和特定基因的过表达是否会影响靶基因启动子活力 ( 图七，Mol Plant. 2012 Sep；5 (5):1042-57. ) 等。
图六 利用 GUS 报告基因检测不同激素 ( 上图 ) 和压力 ( 下图 )情况下基因启动子活力的变化。白框表示对照组，灰 线代表处理组。图片来源于文献：J Exp Bot. 2005 Mar；56(413):909-20.。酶标仪为 SpectraMax Gemini
图七 利用 GUS 报告基因检测 RAP2.11 过表达对 AtHAK5 启动子活力的影响。 图片来源于文献：Mol Plant. 2012 Sep；5(5):1042-57.。酶标仪为 SpectraMax Gemini
3.2 蛋白蛋白相互作用分析
信号转导研究中蛋白之间的相互作用 (Protein-Protein interaction，PPI) 分析是关键的一环，植物研究也不例外。现阶段， 研究植物体内体外的PPI的方式有很多种，包括免疫共沉淀、FRET等。在这我们主要介绍利用酶标仪的两个方法：基于荧光的 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 和基于化学发光的 Split luciferase complementation assay (SLC)。
BIFC 是基于对荧光探针如 GFP、YFP 的 N,C 端拆分并分别和需研究的 PPI 成员克隆在一起。存在相互作用的情况下，探针的 N,C 端接近，具有荧光属性 ( 图八 )。此时就可用荧光酶标仪高通量分析是否存在 PPI。BIFC 的优势是检测体内的PPI存在，同时 结合荧光显微镜还可分析PPI发生的位置 ( 图九，Plant Cell. 2014 Mar；26(3):1345-59. )。
图八 BIFC 原理，图片来源于网址：https://commons.wikimedia.org/wiki/file:BiFC_(details).png
图九 BIFC 应用案例，左图为荧光显微镜分析结果，右图为对应的酶标仪检测结果 ( 36 份独立样本 )， 图片来源于文献：Plant Cell. 2014 Mar；26(3):1345-59. 酶标仪为：SpectraMax M5
SLC 则是基于敏感的化学发光反应，原理和 BIFC 类似，不过不是拆分荧光探针，而是荧光素酶 ( luciferase，图十，上 )。 PPI 发生时，荧光素酶的 N,C 端接近，此时结合引入的底物就可以进行化学发光反应，获得的光信号就可以用酶标仪分析( 图十，中，下 (Plant J. 2007 Oct；52(1):185-95.；Mol Cell.2018 Feb 1；69(3):493-504.e6. )。由于是化学发光检测，SLC 不受植物自发荧 光的干扰，同时也更为灵敏，缺点是无法直观检测 PPI 发生位置。
图十 上，SLC 原理，中，SLC 检测流程，下，利用 SLC 检测候选蛋白之间的相互作用，以及免疫系统的激活对相互 作用的影响。上图和中图来源于文献：Plant J. 2007 Oct；52(1):185-95.。下图来源于文献：Mol Cell.2018 Feb 1；69 (3):493-504.e6. 酶标仪为配备化学发光功能的 SpectraMax 系列
3.3 ROS 分析
与氧化应激密切相关的活性氧簇 (Reactive Oxygen Species，ROS) 在植物免疫信号通路中发挥着关键的作用，也是常规检 测的信号事件之一。与哺乳动物细胞的 ROS 水平检测不同，植物 ROS 信号通常用基于化学发光的鲁米诺 (Luminol) 法。Luminol 在氧化环境下 ( 如结合 H2O2 )，结合合适的催化物就会产光 ( 图十一 )，因此可用于动态追踪 ROS 的水平，例如探究不同 表达条件下和突变情况下植物在鞭毛蛋白 flg22 刺激下的 ROS 反应程度 ( 图十二，Cell Host Microbe. 2014 Oct 8；16(4):48494. ；Mol Cell.2018 Feb 1；69(3):493-504.e6. )。
图十一 Luminol 工作原理，图片来源于网址：https://www.aimsci.com/ros/html/?page_id=285
图十二 左，利用 Luminol 法检测 avrB 的表达对 Flg22 刺激的 ROS 水平的影响，图片来源于：Cell Host Microbe. 2014 Oct 8；16 (4):484-94.，酶标仪为 SpectraMax L。右，研究突变体对 Flg22 刺激的 ROS 水平的影响，图片来源于：Mol Cell.2018 Feb 1；69 (3):493-504.e6.，酶标仪为具有化学发光检测能力的 SpectraMax 系列。
由于 Luminol 反应为快速化学反应体系，因此需要酶标仪配备注射器系统，如 Molecular Devices 的 SpectraMax L， SpectraMax i3x 等 ( 图十三 )。除了 luminol 法之外，结合试剂盒还可通过光吸收法和荧光法进行植物组织的 H2O2 定量 ( 图十四， Mol Plant. 2013 Mar；6(2):337-49. )。
图十三 Luminol 法结果示意图，数据基于配备注射器的 SpectraMax L，应用快速动力学模式，采样间隔 1 秒。 图片来源于文献：Mol Plant. 2013 Mar；6(2):337-49.。酶标仪为SpectraMax Gemini。
图十四 基于荧光法 H2O2 定量，分析基因过表达对 H2O2 的影响。
3.4 基于水母素 (Aequorin) 的钙信号分析
在哺乳动物和人类细胞中，钙离子调控几乎参与了所有核心的细胞信号事件和行为事件，其和磷酸化调控被誉为统治级别的 信号转导方式。在植物中也不例外，钙信号是核心的植物生长和发育的调控者，参与了细胞分裂，激素的下游通路和应激反应等 等 (Plant Cell. 2005 Aug；17(8):2142-55.)。在哺乳动物细胞研究中，钙流通常是基于荧光探针法，然而，在植物中存在多种色素 和自发荧光物质的干扰，因此相关研究会主要基于 Aequorin 法，其主要基于使用过表达的 Aequorin 蛋白。通过三个高亲和力位 点结合钙离子后，在氧的作用下 Aequorin 会不可逆催化 coelenterazine 发出蓝光 ( 图十五，Methods Mol Biol. 2013；1043:4554. )。该反应属于化学发光，可用支持对应检测模式的酶标仪进行分析。
图十五 利用 Aequorin 检测钙流原理图，图片来源于文献：Methods Mol Biol. 2013；1043:45-54.
由于钙离子流动是快反应，因此针对的检测模式为化学发光快速动力学检测，因此仪器需有配备有注射器和化学发光检测能 力，如Flexstation 3，SpectraMax i3x和SpectraMax L等 (图十六)。
图十六 上图，Aequorin 法检测植物钙流结果示意图，数据来源于配备注射器的 SpectraMax i3x。下图，利 用 Aequorin 法检测基因突变对 glutamate 刺激的钙流的影响，突变来源文献：J Exp Bot. 2016 Mar；67 (6):1853-69.。酶标仪为 Flexstation 3
与常见的荧光法不同，Aequorin 本质为化学发光法，因此避免了由激发光带来的光损伤影响，同时也不受化合物自发荧光的影 响，具有更低的背景等优势。
四、利用酶标仪进行植物-微生物相互作用分析
在最后一章中，我们会涉及到植物整体水平的分析，主要关注近几年兴起的植物-微生物相互作用分析。我们会通过两个案 例向大家介绍酶标仪在这个方向的应用。
第一个案例关注植物，如拟南芥与在植物根上常见的微生物如荧光假单胞菌之间的共生关系。为了确认植物来源的变化是否 会影响共生微生物的适应能力，科学家建立基于 24 孔板的高通量筛选系统 ( Rhizosphere assay 图十七，Nat Plants. 2015；1 (6). )。在体系中，通过水培将拟南芥种在 24 孔板中的漂浮网盘上，这样只有根浸入培养基中。再引入标记了 GFP 的细菌，就可 以使用酶标仪进行高通量的微生物增殖分析了( 图十七 )。由于体系培养基中无碳，因此微生物的增殖需要依靠植物本身的光合产 物。
图十七 上图，Rhizosphere assay 示意图。左边放大图可观察拟南芥种于漂浮网盘上，右图为引入微生物 P. fluorescens 7 天后的照片。 下图，基于 Rhizosphere assay 筛选 196 株拟南芥的结果。图片来源于文献：Nat Plants. 2015；1(6).。酶标仪为 SpectraMax M3。
第二个案例同样基于 GFP 蛋白的荧光检测，但是基于检测真菌对植物的侵染机制。一些真菌的效应蛋白，如大豆疫霉菌的 Avr1b 蛋白可直接将 GFP 蛋白转入至植物细胞中，这样就可以通过酶标仪分析靶细胞的荧光检测霉菌的感染能力和进一步机制研 究 ( 图十八，Cell. 2010 Jul 23；142(2):284-95. )。在此，为了获得更具有代表性的荧光信号，我们可使用 Molecular Devices 具有 孔扫描功能的酶标仪进行多点信号的采集和平均。
图十八 基于荧光法动态分析 A549 细胞对霉菌效应蛋白的摄入。 图片来源于文献：Cell. 2010 Jul 23；142(2):284-95. 。酶标仪为 SpectraMax Gemini。
五、总结
上述的案例向我们展示了一些酶标仪在植物领域常见的应用方向。从常规的分子分析、酶活检测到植物信号的研究等，都可 以应用酶标仪进检测和分析，在提高通量的同时简化实验的流程。
针对植物领域 Molecular Devices 提供了包括硬件和软件的解决方案。对于常见的光吸收实验，如紫外法核酸蛋白定量和光 吸收酶活、ELISA 等，我们推荐配备比色皿端口的全波长光吸收酶标仪 SpectraMax Plus 384，其配备了 8 套检测光路，适合于 高通量光吸收分析。针对荧光检测，如报告基因和酶活，推荐灵敏的 SepctraMax Gemini 荧光酶标仪。而针对化学发光检测，如 报告基因，ROS 检测，则推荐具有高达9个动态检测数量级的 SpectraMax L，其能配备注射器体系，适用于各种快/慢反应的检 测。除了单功能外，我们也有支持多个功能检测的酶标仪平台，如经典的M系列和新推出的 iD 系列可供选择。
在软件上，业内领先的 SoftMax Pro 软件可轻松应对检测过程中涉及的分析需求。对于常见的曲线拟合，SoftMax Pro 7 提 供了多达 21 中拟合选择，并且拟合的方式全部可以自定义，因此可用于多种酶活分析等。对于动力学检测，SoftMax Pro 可自动 按需求输出斜率、AUC、最高速度等等。对于光谱扫描，SoftMax Pro 则可自动导出最高吸收峰波长等。只需点击一次，数据采 集到分析到输出就可一次完成。
