分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

离子交换层析实验（二）

2020.8.17

三、结合条件

根据离子交换平衡的一般性原理，很显然，应在很低的盐浓度条件下对蛋白质进行上样 (图 22.1)。盐浓度也必须适当地调节，这具体取决于离子交换剂配体的密度。通常推荐的盐浓度为 1 〇?100_〇 l/L 的缓冲液，其电导率相应为 1?4mS/cm。来源于细菌培养物的一般性原料或细胞培养物，其电导率一般为 15?40mS/cm。这样，所得到的蛋白质溶液必须进行稀释或脱盐处理。稀释是一种简单的方法，但仅适用于小规模。更适宜的方法便是进行透析、渗滤或者以分子筛层析进行脱盐。实验室规模的处理，建议采用分子筛层析。可以使用离心管简易柱、预装柱或自己灌装的层析柱。最大的上样体积为层析柱总体积的 1/3。限制性因素是蛋白质溶液的黏度。黏性指进 (viscousfingering) 使样品扩散加剧，必须减少上样量。

表面移植的离子交换剂能够在原料的电导率较高时上样 (Necinaetal.，1998)。有时，也可以直接用澄清原料上样。但是该原料的电导率必须较低。经过嫁接的表层可以结合许多离子，平衡状态会向着允许蛋白质吸附的状态转移。必须折中考虑结合容量和原料的预处理进行。作为直接上样这种简单处理的交换条件，必须考虑更低的结合容量 (图 22.3)。现代离子交换剂可以在很高的流速下使用，所以即使是结合容量较低也是可以接受的。

根据蛋白质等电点选择缓冲液种类。大于等电点，蛋白质带负电荷，可与阴离子交换剂结合; 而小于等电点时，蛋白质带正电荷，可与阳离子交换剂结合。实际上，选择取决于杂质的分布和蛋白质的稳定状态。具有高等电点的蛋白质，一般宜采用阳离子交换剂进行纯化，并且这类蛋白质很容易被纯化。图 22.4 所示为蛋白质等电点的柱状图。显然，弱酸性的蛋白质更难于纯化, 因为原料中可能会存在一些 Pl 很接近的杂质, 并且含量可能很高。

蛋白质结合的第 2 条原则, 选择缓冲液的 pKa 应接近于所选 pH，最多只能有 1 个单位 pH 左右的差别。

第 3 条原则, 缓冲液本身不能与离子交换剂结合，如乙酸盐或 Tris。所以，不应将乙酸盐用于阴离子交换层析，Tris 也不能应用于阳离子交换层析。若缓冲液与交换剂结合，可引起 pH 不稳定，且操作条件不具有可重复性。

第 4 条原则，当蛋白质接近离子交换剂表面时，可能会暴露于不同的 PH。对于阳离子交换剂，水和氢离子的结合可引起 1 个单位 PH 的下降; 但对于阴离子交换剂，氢氧根离子的结合可引起 1 个单位 PH 的升高。这一点必须记住，尤其是在纯化不稳定性的蛋白质时。

当我们对目标蛋白质 Pl 和其他信息都所知甚少时，需要先进行小规模的探索实验，采用分批或层析柱，以寻求最佳的结合条件。分批的方式，离子交换剂可填装于小型测试的离心管或微孔板中; 选择适宜的缓冲液，改变 PH 或/和盐浓度，使填料达到平衡状态，接着加人蛋白质样品溶液; 先检测上清液中的蛋白质，之后，再向其中加人盐，从柱中洗脱蛋白质, 并再次检测上清液中的蛋白质。采用微孔板的优势是多次实验可平行操作。通过离心可以很容易地将固相和液相分开。当前，一些层析材料供应商也提供即买即用的微孔板。

目前，有些供应商也已经设计出相应的小规模预装柱，它们可以通过注射器或实验室设备进行操作。采用这类微型柱可以很容易地优化结合条件，同时又不会浪费珍贵的样品。离子交换剂的结合容量极高，因此优化过程非常消耗原材料。这类小型柱，如来自于 AtolKWeingarten，Germany) 的 MediaScoutMniColumns，其内径为 5 mm，床高为 10 mm(图 22.5)。每个均有 0?2 mL 层析吸附剂，需要以合适的密度预装，并且对于每种树脂材料均需要分别矫正，这样也是为了在更大体积层析柱中重复操作。