离子交换层析实验（一）
一、实验原理
离子交换层析用于蛋白质分离的原理的最简单解释是，基于带相反电荷分子间的相互吸引力。蛋白质表面所带的电荷取决于其 Pl 和环境 PH。构成离子交换剂的基础介质通常为多孔珠形式，可以为蛋白质的吸附提供足够大的表面积。固定于基础介质上的带电配基可以带正电荷也可以带负电荷。为提高介质的结合容量，可将带电荷的多聚体取代小分子配基植于介质上。无论电荷配基的分子大小, 我们可以将其分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂带负电荷，而阴离子交换剂带正电荷。大于 Pl 时，蛋白质带负电荷，可与阴离子交换剂结合; 小于 Pl 时，蛋白质带正电荷，可与阳离子交换剂结合。前面我们已经讨论了这种简单规则的局限性。离子交换剂本身就相当于酸或碱，而电荷的歧化反应取决于其 pH。强的离子交换剂，本身相当于一种强酸或强碱，在较宽的 PH 范围内，所带的电荷不会发生改变 5 但是，弱离子交换剂却会发生改变。可根据此特性开发离子交换剂的选择性或采用 pH 梯度洗脱。
带电样品与离子交换剂的结合可以通过 Boardman 和 Partridge(1955) 提出的质量作用定律进行描述。FredRegnier 和其研究组扩展了此定律（Kopaciewiczetal.，1983)。
蛋白质的保留时间和盐浓度决定了其与基质表面相互作用的结合位点数量。一般在低盐浓度时使蛋白质结合，而在高盐浓度时洗脱蛋白质 (图 22.1)。等度洗脱的洗脱窗口（elutionwindow) 很低，因此通常以线性盐浓度梯度洗脱蛋白质。
K 为蛋白质在流动相和固定相间的分布系数。它与盐的浓度和结合位点间的相互作用力 Os) 成反比; 见式 (22.1):
式中，K 为蛋白质与固定相的亲和力; 为离子交换的容量。SteveCramer 和其研究组又进一步细化了它们之间的相互关系，并且将吸附蛋白质的离子交换剂表面隐蔽的电荷也纳入了考虑的范畴 (BrooksandCramer,1992)。
可以发现寡核苷酸、多聚核苷酸和蛋白质与交换剂表面结合的位点数量各异 (Yamamotoetal.，2007 父尤其是小分子的寡核苷酸，其结合位点的数目与基序的数量相关。超过某一尺度后，结合位点的数目并不随之呈线性增加，反而水平会下降。质粒可以与许多结合位点结合, 所以能在较低的盐浓度，甚至于 800 mmol/L 时与结合位点结合。而蛋白质通常仅在携带少量电荷时才能够与结合位点结合。
与蛋白质表面带电荷基序相比，蛋白质内部的结合位点数目非常少。仅能观察到 10 个结合位点（图 22.2)。
二、固定相
在过去的几十年里离子交换介质与固定相平行发展。介质需要具备的特性包括更好的机械稳定性、更少的非特异性吸附、更髙的结合容量及更快的质量传递。这些也是新介质开发的主要动力来源。从操作角度看, 这些特性在某种程度上是互不相容的 (MueIler,2005)。而这些特性都是层析操作人员所希望的，因此新材料的开发策略必须平衡上述这些相互矛盾的特性。大颗粒要求低压降，但是通过颗粒的多孔网络扩散的途径较长，造成质量传递速率较慢。较大的孔隙可以提髙质量传递的速率，但同时会减少可利用的表面积，进而降低平衡状态的容量。机械稳定性也同样会受到过大尺寸孔径的影响。同时，固定相的化学组成 (天然的或合成的高分子，无机材料) 也会对多孔球状材料制备产生固有限制。传统上，典型的纯化生物分子常用的固定相由含液体填充孔的颗粒形介质构成。
已经有多种材料用做层析填料 (JanscraandRyden，1998)，其中最常用的有多糖 (纤维素、葡聚糖和琼脂糖)、合成有机聚合物 (聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯) 和无机材料 (二氧化硅、轻基磷灰石）。为生产物理稳定的功能性填料，需对材料进行化学交联, 并连接功能性配基。原材料在生产中体现出的物理和化学条件 (溶剂、介质的浓度和交联剂、温度等) 决定了固定相的特性。这类颗粒的尺寸为 2?2002 用于分析，200fxm 用于低压制备。孔隙尺寸为 10?100nm。在多数情况下，层析介质呈现典型的颗粒和孔隙大小分布并用于制备时，介质的平均表面积为 5?100mVmL 胶。相对于早期采用单种材料为基础的多孔介质，现今最大的改进是复合材料介质的发明，后者可以同时具有两种不同介质的特性。此外还可用其他类型的材料 (Mueller，2005)。其中一个例子就是向后续交联的刚性介质的孔隙中填充高分子材料。这些介质的特征在于蛋白质的固体 (或表面类型) 扩散特性，这种机制是通过孔隙内部形成的凝胶实现的。另外，更为常用的方法是通过移植技术将高分子聚合物黏附于介质表面。这种介质已经显示出极高的结合容量和加速的质量传递，但是确切的机制未知。这类介质还对某些盐类显示出较强的耐受性，所以可以将其直接用于发酵培养液或含有适度盐的原料储存液。其他值得一提的改进还有灌流介质 (Afeyanetal.，1990) 和整体柱 (Tennikovaetal.，1990) 的引入。在灌流层析中，压力快速下降，继而在可渗透的大孔隙内引起流体对流，而表面积大的较小孔隙提供结合容量。整体柱是聚合化的单一整体，其中流体的传输仅仅取决于通过通道时形成的对流，进而驱动全部流动相穿过整个介质填料。需要分离的组分被输送至位于流通孔隙表面的活性基团上，如此形成一个相互作用的网络。选择阳离子交换剂分离蛋白质可参照表 22.1。阳离子交换剂的可选范围非常大，可能超出表 22.1 的范围。表 22.1 中选出的典型交换剂具有不同传输机制，并且列出了可购买获得的材料。
这里并没有讨论用于分析的固定相。与阳离子交换剂相似，我们同样可凭此选择相同介质填料用于阴离子交换剂，只是配基不同。一些供应商也同样会提供相同的介质填料，但具有不同的颗粒直径和/或配体。
