人类血小板抗原1～4系统基因分型
关键词： PCR-SSP；人类血小板抗原；基因分型
摘要 目的：建立人类血小板抗原1～4系统序列特异性引物（PCR-SSP）分型方法。方法：合成14条引物，采用PCR-SSP方法对25名健康献血者的HPA-1～4系统进行基因分型；分型结果与采用等位基因特异性寡核苷酸点杂交（PCR-ASO）获得的结果进行比较。结果：以PCR-SSP方法对HPA 4个系统进行分型均取得了明确、满意的结果，且与PCR-ASO方法获得的结果完全一致。结论：人类血小板抗原PCR-SSP基因分型方法具有简便、快速、准确等优点，具有广泛的应用前景。 中图分类号 Q503 R331.1＋43 Q343．1 Genotyping of Human Platelet Antigen Systems from 1 Through 4
Lu Zhenyu Liu Dazhuang Bao Yuqin
（Blood Group Reference Laboratory of Shanghai Blood Center）
【Abstract】 Objective:To set up the method of genotypeing the human platelet antigen(HPA)systems from 1 through 4 by sequence-specific primers(PCR-SSP).Methods:14 primers were synthesized so that the human platelet antigen systems from 1 through 4 in 25 healthy blood donors could be genotyped by PCR-SSP method.The reusults of genotyping by PCR-SSP were compared with those obtained by allele-specific oligonucleotide hybridization(PCR-ASO) Results:The results of genotyping the 4 HPA systems by PCR-SSP were definite,satisfied and in complete agreement with those obtained by PCR-ASO method.Conclusion: The PCR-SSP method of genotyping the human platelet antigen has the advantages,such as simplicity,rapidity,accuracy and so on,opening up the broad prospects for its further application.
【Key words】 PCR-SSP;Human platelet antigon;Genotyping
迄今，国际上已报道了9个血小板特异性抗原系统，包括人类血小板抗原(HPA)系统1～8以及 Naka抗原［1～3］。这些抗原都是在血小板输注和怀孕介导的同种免疫过程中被发现的。在现代临床输血工作中，为了能给新生儿同种免疫血小板减少症(NAITP)、输血后紫癜(PTP)以及血小板输注无效(PTR)等患者提供正确、及时的诊断和治疗，对病人和献血者进行血小板特异性抗原的准确分型是重要的。血清学方法是现在最普遍采用的血小板抗原分型方法，但应用一直受到抗血清来源和病人血小板数量的限制。20世纪90年代后，随着分子生物学技术的不断发展和对人类血小板抗原基因结构研究的突破性进展，使血小板基因分型更为简捷准确。笔者采用PCR序列特异引物技术(PCR-SSP)对HPA-1～4这4个比较重要的血小板抗原系统进行了基因分型研究。
1 材料与方法 1.1 样本 25名健康献血者静脉采血0.5ml，ACD抗凝。 1.2 基因组DNA抽提 采用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提DNA。 1.3 引物 DNA序列特异性引物设计参照文献［4，5］方法，一共12条，合成序列见表1。内对照为人类生长激素（HGH）基因特异性引物，序列： HGH-1s 5' TGCCTTCCCAACCATTGCCTTA 3'；HGH-2as 5'CCACTCACGGATTTCTGTTGTGT-TTC 3'；扩增产物长度为434bp。 表1 PCR-SSP引物序列、长度及其确定的特异性
| 抗原系统 | 引物 | 特异性 | 碱基序列5'-3' | 长度(mer) |
| HPA-1 | PIA1 | 1a | CTTACAGGCCCTGCCTCT | 18 |
| PIA2 | 1b | CTTACAGGCCCTGCCTCC | 18 | |
| PIAC | common | TGCTTCAGGTCTCTCCCC | 18 | |
| HPA-2 | Koa | 2a | CCCCCAGGGCTCCTGAT | 17 |
| Kob | 2b | CCCCCAGGGCTCCTGAC | 17 | |
| Koc | common | TTGGAGGAGAAGGGTGTCGAGATT | 19 | |
| HPA-3 | Baka | 3a | GGACTGGGGGCTGCCCAT | 18 |
| Bakb | 3b | CAGGTGGACTGGGGGCTGCCCAG | 23 | |
| Bakc | common | GAGAGCCTGCTCACTACGAG | 20 | |
| HPA-4 | Pena | 4a | CTGGCCACCCAGATGCG | 17 |
| Penb | 4b | CTGGCCACCCAGATGCA | 17 | |
| Penc | common | GGTAGAAAGGAGCTATAGTTTGGC | 24 |
1.4 PCR-SSP测定方法 每个PCR扩增体系为40μl，其中包括基因组DNA200ng，10×PCR缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl ,0.001%明胶), 2.5mmol/L MgCl2,375mmol/L dNTP,特异性引物各1.0mmol/L，内对照引物各0.2mmol/L,1.25U TaqDNA酶(美国Perkin-Elmer美国)；扩增采用Mastercycler 5330自动循环仪(德国Eppendorf公司)，首先，94℃10min,接着94℃1min，67℃2min(HPA-2、4系统，65℃2min)、72℃1min循环30次，最后72℃延伸10min。 1.5 扩增产物的检测 取扩增后产物10μl在2％琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5μg/ml)中电泳，约30min后在紫外仪上观察电泳条带，以宝丽来快照记录结果。 1.6 PCR-ASO 按试剂盒说明书操作，通过ELISA方法进行结果检测。 2 结果 2.1 PCR-SSP方法分型 25名健康献血者的HPA-1～4系统PCR-SSP分型结果见表2及附图。 表2 25名献血者的HPA-1～4系统PCR-SSP分型结果*
| 基因型 | HPA-1 | HPA-2 | HPA-3 | HPA-4 |
| a＋b－ | 24 | 23 | 10 | 24 |
| a＋b＋ | 1 | 2 | 13 | 1 |
| a－b＋ | 0 | 0 | 2 | 0 |
| 合计 | 25 | 25 | 25 | 25 |
*与PCQ-ASO分型结果完全一致 M:100bp ladder DNA;*为内对照产物；**为特异扩增产物 附图 HPA-1～4PCR-SSP方法基因分型的电泳结果 2.2 PCR-ASO方法分型 25名健康献血者的HPA-1～4系统PCR-ASO分型结果与PCR-SSP分型结果完全一致。 3 讨论
随着成分输血的深入开展，对HPA分型的需求在日益增长。血清学方法，如混合被动血凝试验(MPHA)、血小板抗原单克隆特异性抗体固定试验(MAIPA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)［4］以及简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)［6］等于血小板抗体的检测固然比较简便，但用于HPA定型则有其不足之处：如血小板抗体血清很难获得，尤其是抗2a和抗3b血清，而且在一些PTP或PTR病人中较难获得足够的血小板用于血清学试验。近来开始出现的DNA分型方法则克服了这些不足，它不需要血小板抗体和新鲜的血小板，只需要少量的全血或组织便可作HPA基因型分型［4］ 。应用于HPA基因型分型的分子生物学方法主要有以下几种：PCR-ASO［7～9］ 、限制性片断长度多态性分析(RFLP)［5］ 、PCR-SSP等。PCR-ASO方法比较繁琐,且判断试验结果不太容易。RFLP方法较PCR-ASO方法简单，但由于其需要限制性内切酶的使用和消化步骤，故仍然较为繁琐，且无法对HPA-4系统作基因型分型［4］ 。PCR-SSP方法允许PCR扩增后，直接凝胶电泳，进行结果判断，所以较前二种方法简单、快速和经济。Tanaka等［4］使用PCR-SSP方法对HPA-2～4系统作了基因型分型，而Klüter等［10］对HPA-1～3，5系统进行了分型。笔者亦尝试以PCR-SSP方法对HPA-1～4这 4个比较重要的HPA系统进行基因分型。通过对PCR中各个反应成分（尤其是MgCl2浓度）及反应循环条件（尤其是退火温度和时间）的选定，增加反应的特异性，减少非特异性扩增，逐个系统进行研究，最终建立了HPA-1～ 4系统的PCR-SSP基因分型方法，且PCR-SSP分型的结果与采用PCR-ASO方法获得的结果完全一致。
本实验研究结果说明，使用PCR-SSP方法对HPA进行基因分型具有简单、快速、经济、准确等优点，故其应用前景广阔，如能给NAITP、PTP和PTR 患者以及一些血小板单采献血者作HPA定型，使血小板配合型输血成为可能，从而提高血小板输注的安全性及有效性。另外还可以对大规模人群进行HPA基因频率的调查，有助于进行人类学的研究。当然，还能对孕妇进行筛选，对新生儿同种免疫血小板减少性紫癜的风险作出正确的估计。
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