免疫组化实验原理和步骤(一)
实验原理:
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性,免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来,以此作为抗原或半抗原,通过免疫动物后获得特异性的抗体,再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的,因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来,以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究。
实验材料:
(一)仪器设备
18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉、水浴锅
(二)试剂
1、PBS缓冲液(ph7.2―7.4):NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。
2、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):柠檬酸三钠3g、柠檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA缓冲液(ph8.0):700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml。
4、1mol/L的TBS缓冲液(ph8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5、 酶消化液:a. 0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6、3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7、风裱剂:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(ph9.0–9.5)等量混合b 油和TBS(PBS)配制
8、TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
实验步骤:
(一)脱蜡和水化:
脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1、 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。
2、无水乙醇中浸泡五分钟。
3、 95%乙醇中浸泡五分钟。
4、75%乙醇中浸泡五分钟。
(二)抗原修复:
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
1、抗原热修复
(1)高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液(ph6.0)。盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。
(3)微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟,反复1-2次。适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等
2、酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、LCA、LN等。
(三)免疫组化染色SP法
1、脱蜡、水化。
2、PBS洗2-3次各5分钟。
3、3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟。
4、PBS洗2-3次各5分钟。
5、抗原修复。
6、PBS洗2-3次各5分钟。
7、滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体。
8、滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时。
9、4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10、PBS洗3次每次2分钟。
11、滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时。
12、Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。
13、PBS洗3次各5分钟。
14、DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度。
15、PBS或自来水冲洗10分钟。
16、苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化。
17、自来水冲洗10-15分钟。
18、脱水、透明、封片、镜检。
(四)SABC法
1、脱蜡、水化 。
2、PBS洗2次各5分钟。
3、用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次(4)抗原修复。
4、PBS洗5分钟。
5、滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体。
5、滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时。
6、PBS洗3次各2分钟。
7、滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分钟。
8、PBS洗3次各2分钟。
9、滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟。
10、PBS洗4次各5分钟。
11、DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色。
12、脱水、透明、封片、镜检。