流感病毒与流感疫苗
1. 流感病毒的形态及实验室分离纯化：
引起人类流感的病毒是冠状病毒。冠状病毒只感染脊椎动物。
感染流感病毒后会引起人与动物的呼吸道、消化道与神经系统病患。
流感病毒的代表型在上世纪 60年代被查明， 60年代后对各种流感病毒的完整形态已进行了深入研究。冠状病毒的基因图谱序列（包括各种蛋白酶和病毒内部的核甘酸序列）已被查明。
流感致病病毒几何尺寸：平均直径 100～200nm沉降系数约为 700S~800S。
病毒（全病毒）在蔗糖液中浮密度约为 1.15～1.19g/ml
病毒形态：近似球形，中心部分核酸，最外部为纤突，是血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的大分子，它附着在具有保护作用的脂质膜上，纤突是病毒侵害人体细胞时附着道细胞上的吸附器，也是中和抗体的抗原。这二种表面抗原可以独立或同时发生变异。
HA的变异性很强，是流感发生变异的主要原因。脂质膜内依次是膜蛋白、螺旋壳膜子粒、核酸链。
核酸：流感病毒的核酸为双股线型 RNA，同种冠状病毒的核酸序列是恒定的，但病毒发生变异后，核酸与蛋白的序列会发生某些微小变异。
病毒如何侵入人与动物细胞：纤突吸附到细胞膜上→病毒
RNA进入人体寄主细胞→病毒核酸复制→病毒蛋白合成（包括病毒壳膜及子粒），病毒的 RNA既可以直接作为 mRNA也可以转录形成一个互补的
RNA股。病毒进入寄主细胞后其信息通过人体细胞生物合成机制提供产能系统、核蛋白体、氨基酸活化酶、
tRNA和其他成分来指导合成一系列病毒蛋白。接着，病毒自身作为复制模板在特异聚合酶作用下复制，并用上述由病毒核酸指导合成的病毒蛋白集合成壳膜，组成一个新的病毒颗粒。
流感病毒由多个基因组片段分节段构成，在感染细胞时，病毒基因组片段可发生重组。产生数百种遗传学不同的重组子病毒亚型。这些重组病毒亚型具有父母代双方的
RNA片段，而且多种不同的抗原变异株或重组子病毒可同时在脊椎动物中循环存在，在适应过程中通过基因重排，交换或功能互补使其致病力发生改变，从而导致新的流行病毒株的出现。
全病毒分离纯化：培养液经层析、超滤或高速连续流离心得到浓缩全病毒的上清液。小容量可用超速离心机，最高转速为
40,000rpm的甩平转头，10～50％或类似蔗糖梯度作等密度离心 30,000rpm~35,000rpm，1～2小时，5℃。病毒应沉降在
30％～40％蔗糖梯度之间的某个位置形成纯病毒区带。用密度梯度仪（如日立
DGF-U）把管中液体自上而下用管道泵自动抽样接至分光光度计流动池进行光密度连续检测，经部分收集器分部收集并给出从管上部液面到管底的容量——光密度曲线，从曲线的尖峰位置确定病毒所在的收集离心管编号（每个离心管分批收集成
50～100管）。经透析及其他处理后得到纯病毒浓缩液。
病毒裂介后纯化处理：用 Triton X-100或乙醚裂介后高速离心浓缩抗原蛋白，然后用超速离心机作密度梯度离心纯化。
中试和批量生产：根据生产规模可用低速大容量离心机或高速管式离心机或高速离心机高速连续流转头、大容量层析、超滤设备、超速区带离心，超速连续流离心直至大容量超速连续流离心机作最后分离纯化。
2. 流感疫苗的应用：
重要性：流感会引起区域甚至世界性大流行发病率和死亡率很高，对于儿童与老年人，发病率与死亡率更高。由于目前全世界各国老年人口增加比例高于其他年龄段，流感大范围流行的后果将十分严重。目前唯一可行的预防措施是疫苗接种。流感全病毒灭活疫苗在全世界范围内使用已半个多世纪，50多年来由全病毒灭活疫苗→裂介的疫苗→亚单位疫苗已经有了很大进步（高度纯化、热原成分极少、注射疫苗后负作用降低……）疫苗生产规程： 1968年，世界卫生组织公布了第一个流感灭活疫苗生产规程。（WHO TRS-384） 1973年，对以上规程作了补充（WHO TRS-530）。 1979年，以后几年又对疫苗血凝素含量的测定方法作了改进。，并进一步修订了规程于 79年公布了新规程（WHO TRS-638）。此后 10多年中由于生产厂积累了丰富的经验，特别是连续传代细胞系在疫苗生产上有了很大进展。WHO根据当时的实际情况又在 1989、1990、1991、1995年制定了新的流感疫苗生产和灭活规程。我国在 2004～2005年出版了以 95年 WHO规程为基础的新规程。
3. 流感病毒的变异：
流感病毒的流行病株多年来已发生多次变异，由于病毒毒株的变异。流感病毒（疫苗）和其他疫苗的不同之处在于毒种必须经常改变以对付当年流行流感病毒。因此 WHO每年要发布当年疫苗中应包括的毒种的建议。近年来，导致流感的致病病毒的抗原蛋白（血凝素及其其他蛋白）的氨基酸序列以及三维结构都已被测定（包括 2004年流行的 SARS病毒），已经确定血凝素分子的改变可以造成抗原性质改变并出现新的流行毒株。目前的科研水平还不能预测未来的变异情况，因为在抗原漂浮过程中发生的抗原变异株的选择机制还不能认定。变异会有很多种进化途径，对于未来出现新的血凝素亚型毒株（抗原变异）而造成新的流感爆发也是很难预测的。除了抗原变异和抗原漂移，研究还证实在流感病毒之间还存在另外一种类型的抗原变异：即在不同宿主细胞培养生长条件下可能会产生某些流感病毒的亚群。如在鸡胚或鸭胚中生长的流感病毒与在传代细胞 MDEK（狗肾）中分离和传代培养的流感病毒相比，前者常会发生很小的抗原变异，对血凝素（蛋白）测序表明：在哺乳动物细胞中培养的流感病毒与在鸡胚中培养的同株病毒相比，它们之间只存在单个氨基酸的替换。到目前为止造成流行的流感致病病毒，通常含有一种或多种 A（甲）型病毒，但是当 A（甲）型流感病毒出现一个新的亚型，即带有新的血凝素和神经氨基酸的抗原时，含有以往流行亚型的 A（甲）流感病毒抗原则变为无效。因此又必须使用含有新的流行毒株的抗原和疫苗。在世界性大流行的年代中已经发现 A（甲）型流感病毒的血凝素和神经氨基酸抗原发生了连续不断的抗原漂移，含有前一个流行毒株的疫苗对于后来的流感的防治效果较差。而 B（乙）型流感病毒毒株没有发现亚型的变异，但有抗原变异，其变异程度比 A（甲）型病毒低得多。在多价疫苗中 B（乙）型流感病毒毒种的变化很小。因此流感疫苗中一般只含一种 B（乙）型流感毒株抗原。
4. 流感疫苗效力的测定：
WHO规定：流感疫苗的效力以每 ml注射剂中所含有血凝素的μg数来决定。测定方法：免疫扩散试验。确定参考抗原和抗血凝素的特异血清。参考标准由
WHO或国家生物制品标准和鉴定研究所及国家生物制品评审和研究中心制备和分发，当生产疫苗需要新毒株时，将随时制备和提供新的参考抗原和抗血清。值得注意的是由于流感病毒的抗原变异，固定
A型和
B型病毒的抗原量是不合理的。对于不同的变异毒株，产生有效免疫的抗体水平所需的抗原是不一样的。另外，疫苗接种对象的免疫应答程度取决于年龄，是否感染过与接种疫苗相关的血凝素和神经氨基酸蛋白抗原的免疫经历、剂量、接种疫苗的类型（全病毒、裂介病毒抗原或纯化表面抗原）。
5. 流感疫苗的生产：
I. 什么是流感疫苗：流感疫苗是无菌的灭活病毒悬液，由 A（甲）型或 B（乙）型流感病毒的一株或多株或二型混合液组成，病毒在鸡胚中分别单独培养。流感疫苗分为三种：
用适当方法灭活的全病毒悬液；
用物理化学方法部分或完全裂介处理病毒颗粒的无菌悬液（裂介疫苗）
经处理后主要由血凝素和神经氨基酸抗原制成的无菌悬液（亚单位疫苗）
目前还可以通用具有表面抗原的高密度繁殖培养的重组病毒株生产的流感疫苗。
II.
血凝素参考品：当流感在某地区或世界可能将或已经开始流行时，WHO将流行的新病毒株列入疫苗生产范围并立即发放每
ml中含有标定的μg数的流行流感病毒的血凝素，由国家有关部门分发给各个流感疫苗的生产厂和检定研究所实验室，用免疫扩散法测定产品的血凝素抗原，并和标定抗原进行比较和鉴定。
III. 疫苗生产 严格按照 WHO及国家有关部门规定进行生产厂的检察及内部装修设计，特别注意区域隔离、灭菌消毒、设备有效性、生产人员的安全保证等等。
严格控制生产原材料：只有经过国家监控部门批准的毒株方可用于生产。灭活流感疫苗用的病毒株必须有经鉴证的记录（原始株及后续处理资料；用于高产表达表面抗原的重组株病毒在培养过程中可能发生抗原变异，因此必须用血凝素单克隆抗体试验或动物免疫血清血凝抑制试验证明无此抗原变异。
种子批：疫苗生产只能用工作种子批，工作种子批只能传一代，种子批病毒必须确认不含外源性活微生物（如用鸡胚制备的种子批必须确认无鸡白血病病毒和腺病毒）。液态种子批储存在－60℃以下，冻干品保存在－20℃以下。
病毒繁殖：用于生产流感灭活疫苗的流感病毒用鸡胚培养，鸡蛋应来自健康鸡群并经国家有关部门批准。用工作种子批病毒对每个鸡胚尿囊腔注射
0.2ml， 33℃～37℃培养
3天。培养后只能收获鸡胚尿囊液和羊水，不允许在任何过程中使用含有β－丙酰胺的抗生素（允许使用其他微量适宜的抗生素）如果疫苗用裂介病毒制成，裂介条件、使用的化学试剂品种及浓度必须经国家批准。
灭活：单价病毒合并液在制成后应尽快灭活，灭活前保存于 5℃±3℃不超过
5天。在灭活前应检查有无细菌或霉菌污染。灭活方法经国家批准且必须能杀灭鸡白血病病毒和支原体。【如使用福尔马林（40％甲醛）或β－丙烯内脂，浓度不能超过
0.1％】。灭菌后病毒合并液储存于 5℃±3℃。
浓缩和纯化：一般用超速离心法（超速区带离心或超速连续流离心）可以在灭菌前或灭菌后进行。浓缩或纯化过程中应最大程度地保护血凝素和神经氨酸酶抗原。
产品鉴定：要进行表面抗原浓度测定、抗原鉴别试验、灭菌试验、总蛋白量测定（蛋白含量不得超过血凝素含量 6倍，但在任何情况下，一个人份剂量的一个毒种蛋白量不超过 100μg，一个人份总蛋白量不超过 300μg）、卵白蛋白测定（一个人份剂量卵白蛋白含量不得超过 5μg，可以低于 1μg）、血凝素测定（一个人份剂量中血凝素含量为 7～20μg，按标签上的血凝素含量，实际含量应在 80％至 120％之间；还要用鲎试剂做内毒素测定。
附件：
一些有关的术语：
母种子批：（Master seed lot）:从 WHO推荐的一株病毒在同一时间内培养得到的一定数量的同一成分的病毒。母种子批用于制备工作种子批。毒种母种子批及其传代代数均由国家有关部门批准。
工作种子批:（Working seed lot）:由毒种母种子批培养所得到的一定数量的病毒为同一成分病毒，经过全面鉴定。病毒传代代数不得超过国家检定当局批准的最长代数，工作种子批用于疫苗生产。
单一收获物：（Single harvest）:用同一毒株同时接种并同时收获的一定数量的病毒液。
单价病毒合并液：用同一病毒株在同一时间生产的一定数量的单一收获液的合并液。
半成品：（Final bulk）:将一批或数批单价病毒合并液置于一容器中并由此分装到疫苗瓶中。半成品可以含有一个或数个病毒株。
成品批：一批已分装并封口的疫苗瓶，在分装过程中受污染的危险性是相等的。因此，成品批必须是由一批半成品在同一工作程序中分装的疫苗。
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