固相化金属亲和层析法纯化蛋白质实验
固相化金属亲和层析法
| 实验方法原理 |
固相化金属亲和层析的原理是利用暴露的蛋白质残基和介质上的金属离子之间的相互作用进行纯化。作为电子供体的表面氨基酸，特别是甘氨酸，与金属离子螯合时，在金属亲和柱内含这些氨基酸残基的蛋白质就受到阻滞。由于电子供体一定是未质子化的，至少部分是如此以便螯合金属离子，所以越碱性的溶液蛋白质与金属亲和柱结合越强。 为了能和蛋白质相互作用，固相化的金属离子必须是易于接近的。这种可接近性是这样实现的。从介质伸出一些亲水的臂，其末端与金属形成复合物。市售的、典型的用于金属螯合的介质是亚氨基乙酸（IDA）。当需要更紧的蛋白质－金属结合时，羧甲基乙二胺（TED）Sepharose 也是可以用的。如果几乎没有关于将要纯化蛋白质特性的信息，则铜是首选试用于金属亲和柱的金属。常用的其他金属有镍、锌、钴和钙。没有一个现成的方法可以用于选择最佳金属离子，只能推荐反复试验筛选。在金属亲和层析过程中，应用高盐溶液（0.5～1 mol/L NaCl） 可以减少非特异离子相互作用。此外，在蛋白质结合前和过程中定要避免金属螯合剂（EDTA、EGTA 和柠檬酸盐）。 |
|---|---|
| 实验材料 | 蛋白质样品液 |
| 试剂、试剂盒 | 五水硫酸铜 磷酸钠盐缓冲液 NaCl EDTA |
| 仪器、耗材 | 层析柱 |
| 实验步骤 |
1. 10 ml IDA－Sepharose 6B 装填一个柱子。柱长与柱径比例可随目的蛋白结合的紧密程度不同而变化。结合较紧的目的蛋白用短而粗的柱子就能很好地分离； 2. 3 倍柱床体积的水洗柱； 3. 3 倍柱床体积的 1mg/ml CuSO4·5H2O 洗柱； 4. 5 倍柱床体积的层析缓冲液（20 mmol/L，pH 7.5 磷酸钠盐缓冲液，0.5 mol/L NaCl）洗柱； 5. 用层析缓冲液处理蛋白质样品液，即用该缓冲液透析或 1：1 稀释。再经离心或过滤获得澄清的样品液。介质结合容量决定柱子的有效载样量，通过试验测定柱子的总结合容量是非常有用的。通常结合容量的合理估计是每 ml 介质结合 10～100 mg 蛋白质； 6. 将样品液（蛋白质浓度 1～10mg/ml）上样到金属亲和柱； 7. 5 倍柱床体积层析缓冲液洗柱，或洗至 A280 值回到甚线； 8. 5 倍柱床体积洗脱缓冲液（100 mmol/L，pH 5.0 乙酸钠，0.5 mol/L NaCl）洗脱目的蛋白； 9. 含 50 mmol/L EDTA 的层析缓冲液既可用于洗脱较强结合的蛋白质，也可用于柱子的再生。 另一个洗脱策略是金属结合竞争法，例如增加咪唑、组氨酸、甘氨酸或氯化铵的浓度，从而与目的蛋白竞争金属离子结合位点达到洗脱目的。促溶剂（脲）或去垢剂也有助于强结合蛋白质的洗脱。 浓度梯度洗脱也可试用来代替上面介绍的洗脱步骤。 |
