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报告基因：β-半乳糖苷酶的原位染色实验

2019.11.12

原位染色技术

实验方法原理	β-半乳糖苷酶是一种常用的报告基因分子，通过原位染色，在普通的光学显微镜下就可以用于检测到β-半乳糖苷酶的表达。
实验材料	β-gal表达质粒转染细胞
试剂、试剂盒	D-PBSA 染色液
仪器、耗材	6 孔培养板恒温箱倒置显微镜
实验步骤	一、材料非消毒物品 1. D-PBSA 2. 底物：X-gal（nvitrogen），以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL，用多聚丙烯管-20℃ 避光保存，最长可达 6 个月 3. 固定液：1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛，均以 PBSA 液配制；将 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福尔马林（37% 甲醛溶液）及 0.2 mL 戊二醛（25% 溶液）混合，制备成固定液，于 4℃ 储存 4. 染色液：含 5 mmol/L 铁氰钾，5 mmol/L 亚铁氰钾，2 mmol/LMgCl₂，以 D-PBSA 配制，4℃ 储存 5. 底物/染色液：1 mg/mLX-gal，以染色液配制，现用现配 6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液 7. 将β-gal 的表达质粒作为报告基因转染（如：pcMV β-gal ）二、操作步骤： 1. 用 2 mL D-PBSA 液洗涤细胞（如在 6 孔培养板上）。 2. 用 1 mL 固定液于室温下固定细胞 5 min。 3. 用 2 mL D-PBSA 洗涤细胞 2 次。 4. 将 1 mL 底物/染色液加入到每个培养孔内，37℃ 孵育 2 h。 5. 用 2 mL D-PBSA 液冲洗每孔细胞，在倒置显微镜下观察细胞，计数蓝染（β-gal 阳性）细胞。 6. 培养板的储存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的缓冲盐溶液，室温下固定 10 min，然后用缓冲盐溶液洗涤细胞，4℃ 储存缓冲盐溶液。展开
注意事项	1. β-Gal Fixative有一定的腐蚀性和气味，操作时请注意防护。 2. β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在二氧化碳培养箱中进行染色反应。用于细胞培养的二氧化碳培养箱中较高浓度的二氧化碳会影响染色工作液的pH值，而导致染色失败。 3. 配制染色工作液时需使用聚丙烯（polypropylene）容器或玻璃容器，不宜使用聚苯乙烯（polystyrene）容器。但染色时可以在聚苯乙烯（polystyrene）容器中进行，例如普通的6孔板就可以用作染色的容器。展开
其他	1. 一种基于衰老时SA-β-Gal （senescence-associated β-galactosidase）活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测。 2. 对于组织切片：（1）对于石蜡切片先按照常规方法进行脱蜡和水化处理。对于冷冻切片直接按照以下步骤进行。（2）加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15分钟。（3）用PBS浸泡洗涤组织3次，每次不少于5分钟。（4）普通光学显微镜下观察。如不能及时观察，加上封片液封片后4℃可以保存较长时间。来源《动物细胞培养：基础技术指南（第五版）》展开