亲和层析实验：常规方法（二）
二、配基的选择
选择合适的配基，需要对配基和靶分子之间的天然相互作用有一定的认知及理解。
靶分子与配基的相互作用必须是特异性结合，并且在不同的结合和洗脱条件下均应该稳定。此外，制订亲和纯化的方案时，需着重考虑能否购买到商品化配基，还是需要从头研制配基和介质。后者的成功在很大程度上取决于对蛋白质结构和相互作用特性的已有认识，需要采用分子模建、化学合成和有机偶联联合以及对选择性结合的分析。事实证明，设计一个新型配基、开发合适的偶联化学作用和介质的时间和精力过于冗长和昂贵，因此这种情况下使用非亲和纯化技术可能是一个更好的选择，如离子交换和疏水相互作用。
1.设计和选择配基的一般注意事项
在开发一个新的亲和纯化材料时, 配基和靶分子之间的亲和力是最重要的注意事项。
低亲和力会降低结合效率, 导致回收率下降。亲和力过高，苛刻的洗脱条件会导致目标蛋白质洗脱效率低或使其灭活，进而降低回收率。一般来说，亲和常量为 IO6~IO8mol-1 时, 可用于亲和纯化。与目标蛋白质结合的亲和配基，在与亲和介质连接前最好先进行评估。要注意的是固定后配基的亲和力可能与在溶液中的亲和力不同，某些情况下，甚至可能改变特异性。
共价偶联是将配基吸附于介质的首选方法，可以降低在纯化过程中滤去配基的风险。
然而，在没有活性基团存在的情况下也可以使用非共价吸附策略，或是用于降低配基变性的风险，如非特异性吸附、生物特异性的相互作用(生物素-链霉素）、包封(entrapment)及最近开发的分子印迹(Alexanderetal.,2006)。详情请参阅本章第4节。
配基与靶标之间结合能力的降低，除亲和力弱这一因素外，也可能是因为基质或其他配基导致的空间位阻引起的。配基和介质之间间隔物的介入能够降低介质造成的空间位阻(Hageetal.，2006)。设计间隔臂(spacerarm)时，应该考虑其长度和疏水性两方面，因为可以通过增强亲水性而减少配基与靶标外其他分子的非特异性相互作用。间隔长度的优化也很重要，间隔太短也许不能缓解介质的空间位阻效应，间隔太长则可能会促进非特异性的相互作用, 或者可能会形成自身折叠从而限制特异性的相互作用。表面的配基密度也要进行优化。非常高的配基密度可能产生反作用, 造成结合能力丧失，原因可能是结合位点靠的太近形成空间位阻，或是强结合力限制洗脱效率(Hageetal」2006)o其他因素也可能影响最佳配基的选择，如能否消毒、配基的稳定性、适当的储存条件和价格等。
2.固定化配基的特征
亲和树脂是否具备在重复应用中保持性能相似的能力是判断其实用性的—个重要因素。因此，确定最佳反应条件以保证性能一致显得十分重要，包括优化合成所需的配基数量。确定合成中所需最佳配基量可以防止配基过多造成浪费, 进而降低成本。
对于共价连接，一般需要分析介质可连接的配基数量，并确定偶联条件如何影响固定配基的数量。确定配基密度的一个简单方法, 是分析反应后剩余的配基数量。偶联完成后，用初始的配基总量减去剩余的配基数量。根据配基的性质，应采用不同的检测方法，如分光光度法、BCA法(检测蛋白质)、Ellman，s埃尔曼试剂（检测巯基）、荧光检测或其他检测方法（Guilbault,1988;Langone,1982)。
某些情况下，如通过氨基酸分析或元素分析, 可以直接检测载体上的配基，但是这会破坏材料，因此只适合少量检测。结合能力评估可以间接评价固定化配基, 使亲和介质处于纯化所需条件下，评估保留在介质上的靶分子数量。这种方法与亲和介质的性能直接相关，因此可能是固定化配基最有意义的检测形式。最大载量需在平衡状态下评价，通常以缓慢的流速或以直接混合的结合模式进行。注意：由于动态结合受到流速、介质孔隙内质量转移以及亲和常量的影响，因此动态结合能力可能与最佳结合能力不同。
3.运载特定配基的亲和介质
近年来，我们见证了针对不同靶分子的亲和配基以及商品化特异性介质的迅猛发展。
常用商品化配基的概述见表
26.2,
但并未涵盖所有可购买的配基。现有大多数可购买的亲和介质连接的配基通常称为「组特异性配基」(groupspecificligand),
表现为对一组结构或功能相似的蛋白质形成亲和连接，可以用于纯化具有类似功能的不同目标蛋白质。在下面的章节中，我们描述一些亲和介质常用配基。
4.免疫球蛋白结合蛋白质
免疫球蛋白的恒定区(Fe)与ProteinA 或 ProteinG之间可以结合，以此为基础的抗体纯化是亲和纯化中最有效并且常用的方法之一。ProteinA来源于金黄色葡萄球菌，ProteinG来源于链球菌。两者均为细菌相关蛋白，可以与IgG类抗体结合—-这些抗体可以为不同亚型, 也可以来源于不同有机体。目前有很多关于 ProteinA和ProteinG亲和力差异的详细说明，如供应商提供的商品化产品说明（Gussetal.，1986;Hageetal.，2006)。此外，最近ProteinB和ProteinL 作为免疫球蛋白结合蛋白应用广泛。proteinB是一类A链球菌的表面蛋白，可以结合某些人IgA型抗体，ProteinL[马格努斯消化链球菌(Pe辦OSZr印tococcwsmagmfs)]能够与kappa轻链相互作用, 且不影响抗体的抗原结合位点（Faulmannetal.，1991;Hermanson，1992)。因此ProteinL成为唯一的适合纯化缺乏Fc区抗体的蛋白质。
大多数情况下，在中性或接近中性 pH 的条件下抗体结合能力较好, 但不同样品的最适pH并不相同，这取决于具体使用的蛋白质。ProteinA在pH8.2时结合抗体的能力最强，ProteinL为pH5,ProteinG为pH7.5，但ProteinG也可以在pH7~7_5时使用。样品洗脱常为酸性 pH(2.5~3.0)环境, 为避免样品在低pH洗脱过程中变性或丧失生物活性，将其收集在中性或弱碱性缓冲液中。为防止低pH洗脱造成生物稳定性丧失, 需要探索盐梯度与pH梯度结合的洗脱方式。
5.凝集素
凝集素是一组多样化蛋白质，可以结合碳水化合物，具有高度的特异性。每一种凝集素都具有自己特异的使用方案。常用于从复杂的糖复合物中亲和纯化或浓缩碳水化合物基团，如多糖、糖脂和糖蛋白。还可以根据糖基化的特点，特异性分离不同的糖结构模式 (glycolform)。现在，凝集素不仅应用于纯化含糖分子，也可以用于质谱分析时浓缩糖蛋白亚类(Hirabayashi，2008)。详见第34章。
目前有超过1 00种的商品化凝集素，包括结合形式和单体形式，其中大部分是植物来源。来源于直生刀豆(CanawZiaensi/onm’s)的凝集素，即刀豆球蛋白A(ConA)是最常用的凝集素(Hermanson，1992), 其可以与『1>甘露糖、萄糖和JV-乙酰葡糖胺亲和结合。另外两个广泛使用的凝集素是麦胚凝集素(WGA) 和榴莲凝素(jacalin)。WGA 结合唾液酸和含有的N-乙酰-1>氨基葡萄糖残基的分子, 榴莲凝素结合 D-半乳糖基团。
通常在中性 pH、含糖条件下，将凝集素偶联到树脂上，这可以保护糖结合位点。靶分子通常也需要在中性 pH 条件下与凝集素结合。需要注意的是，有些凝集素需要二价金属离子的存在，这样更有利于靶分子结合，如 ConA 结合需要 Ca2+和 Mn2+。在洗脱缓冲液中加入过量的特异性糖分子进行洗脱，也可以进行梯度或分段洗脱。洗脱后，可通过透析或分子排阻的方法除去游离糖。
