Northern杂交
实验概要
本实验介绍了Northern杂交的基本流程。
主要试剂
液氮，TRIzol (Invitrogen)，DEPC水，氯仿，异丙醇，70%酒精，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，水饱和酚(PH4.3)，无水乙醇，NaOAc，抽提缓冲液(0.02M NaOAc，1 mM EDTA，0.5% SDS)，RNase-free DNase，上样缓冲液(500ul formamide，100ul 10X MOPS，170ul formaldehyde，5ul ethydium bromide)，琼脂糖，10 X MOPS缓冲液(200 mM MOPS，20 mMNaOAc，10 mM EDTA)，杂交缓冲液(200mM磷酸钠缓冲液，PH7.2，1 mM EDTA，50%甲酞胺，1% BSA，7% SDS)，机引物标记试剂盒，洗脱缓冲液(2 X SSC，0.5%SDS)
主要设备
研钵，高速离心机，摇床，水浴锅，电泳仪，电泳槽，Phosphorlmager，硝酸纤维素膜和两张Whatman滤纸，转移装置，紫外胶联仪，杂交瓶
实验材料
植物叶片，细菌
实验步骤
1. 植物RNA提取
1) 取5-6片植物叶片液氮速冻，研磨成细小粉末。
2) 加入1mL提取缓冲液TRIzol (Invitrogen)研磨直至均匀，于室温孵育5分钟。
3) 加入200ul氯仿抽提2-3分钟，12000g于4℃离心10分钟。
4) 将上清转移至新管，加入500ul异丙醇于室温孵育10分钟，12000g于4℃离心10分钟。
5) 弃上清，加入1mL 70%酒精洗涤。
6) 短离心去除酒精，晾干后加入适量DEPC水溶解。
2. 细菌RNA提取
1) 接种单克隆于2mL含相应抗生素的液体培养液中，28℃摇床培养过夜。
2) 12000rpm离心30秒收集菌体。
3) 弃上清，加入0.4mL 60℃预热的水饱和酚(PH4.3)，剧烈震荡至细菌完全悬浮。
4) 加入0.4mL 60℃预热的抽提缓冲液(0.02M NaOAc，1 mM EDTA，0.5% SDS)，剧烈震荡。
5) 60℃水浴5-10分钟后转移至冰上冷却。
6) 12000rpm离心5分钟，取上清。
7) 加入0.4mL 60℃预热的水饱和酚(PH4.3)，剧烈震荡后转移至冰上冷却，于4℃12000rpm离心10分钟。
8) 重复步骤7)。
9) 取上清，加入0.4mL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈震荡后于4℃ 12000rpm离心。
10) 加入2.5倍体积无水乙醇和0.1体积NaOAc混匀后-20℃沉淀1小时。
11) 12000rpm离心10分钟，弃上清，加入1mL 70%酒精洗涤。
12) 短离心去除酒精，晾干后加入400ulDEPC水溶解。
13) 加入1ul RNase-free DNase，37℃孵育1小时。
14) 加入0.4mL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。
15) 按照步骤10)和11)沉淀RNA。
16) 短离心去除酒精，晾干后加入50ulDEPC水溶解。
3. Northern杂交
1 ) 称取2g琼脂糖，加入140mL水煮沸直至琼脂糖完全溶解。
2) 等到琼脂糖稍冷却后加入20mL 10 X MOPS缓冲液(200 mM MOPS，20 mMNaOAc，10 mM EDTA)和40mL甲醛，混匀后灌制甲醛变性胶，浸泡于1 X MOPS缓冲液中。
3) 取10ug RNA与3倍体积的上样缓冲液(500ul formamide，100ul 10X MOPS，170ul formaldehyde，5ul ethydium bromide)混匀，65℃加热15分钟，迅速置于冰上冷却。
4) 上样后120伏电压电泳约3小时。
5) 电泳结束后，用去离子水漂洗RNA胶，并照相。
6) 搭建转移装置，并装入10 X SSC。
7) 切一张与RNA胶相同大小的硝酸纤维素膜和两张Whatman滤纸，并在膜左上角标记，先后用去离子水和10 X SSC漂洗。
8) 按顺序先后将RNA胶和硝酸纤维素膜铺在转移装置上，并用保鲜膜封边。再铺上两张Whatman滤纸，用500g重物压实，转移过夜。
9) 去掉Whatman滤纸，在硝酸纤维素膜上标记加样孔的位置，用2XSSC漂洗后晾干。
10) 用紫外胶联仪将RNA胶联到硝酸纤维素膜。
11) 配制杂交缓冲液(200mM磷酸钠缓冲液，PH7.2，1 mM EDTA，50%甲酞胺，1% BSA，7% SDS)。
12) 将膜放进杂交瓶，RNA而朝向空气。
13) 加入1 5mL杂交缓冲液，于42℃预杂交2-3小时。
14) 用随机引物标记试剂盒(Ambion)方法制备探针，变性后加入杂交瓶，杂交16-20小时。
15) 去掉杂交液，用预热至40-50℃的洗脱缓冲液(2 X SSC，0.5%SDS)洗两次，每次5-10分钟。
16) 用预热至40-50℃的洗脱缓冲液(1X SSC，0.5%SDS)洗两次，每次5-10分钟。
17) 用预热至40-50℃的洗脱缓冲液(0.5X SSC，0.5%SDS)洗两次，每次5-10分钟。
18) 取出膜后晾干储存于Phosphorlmager。
19) 24小时后放射自显影。
