Northern杂交操作步骤和DNA探针的制备与标记（1）
一．原理
Northern 杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：
1. 完整mRNA的分离
2. 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离
3. 将RNA 转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布
4. 将RNA固定到支持物上
5. 固相RNA与探针分子杂交
6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子
7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析
二．DNA 探针的制备与标记
1．材料
纯化的PCR产物
2．仪器
电泳仪，紫外分析仪， 离心管，移液枪，碎冰
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
3．试剂
10× transcription buffer；10× nucleotide mix (10mm each ATP GTP CTP)；20U RNase
inhibitor；40U T7，T3or SP6 RNA Polymerase；DMPC处理水；DNase I (40U) RNase free；
EDTA (0.2M PH 8.0)；RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)
4． 方法
(1) 将10ng-3μg 纯化模板DNA，RNase-free 水加到灭菌RNase free 1.5ml 离心管中，终
体积为15 μl。
(2) 沸水浴10min后快速置于冰上。
(3) 依次加入下列试剂
(4) 短暂离心，温和混合，37℃保育1-20h。
*注意：过长时间保育不能增加标记RNA产量
*注意：仅在RNase保护试验中被要求。
(5) 加65℃温育10min或加入2μl 0.2M EDTA ( PH 8.0)终止反应。
(6) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA探针长度。
(7) 探针分装保存在-20℃备用
*注意：避免探针反复冻融。
三．Northern杂交
1. RNA分离与转膜
1）材料
注：实验中所有的试剂的配置都要使用无RNase的水。
（1）10 × BPTE 电泳缓冲液
100mmol/L PIPES (piperazome-1, 4-bis (2-ethanesμlfonic acid)， 哌嗪-, N’
–双(2-乙磺酸)) ； 300mmol/L Bis-Tris (bis [2-hydroxyethyl] iminotris
[hydroxymethy] methane) ；10mmol/EDTA (pH8.0)；10 × 缓冲液的最终pH 值约为6.5。10 ×
缓冲液的配置:将3g PIPES(游离酸), 6g Bis-Tris (游离碱)，2ml 0.5 mol/L的EDTA (pH8.
0)加到90ml 双蒸馏水中，在37℃用终浓度为0.1%的DEPC处理1h，然后高压灭菌
（2）乙二醛
商业储存的乙二醛溶液(40%或6mol/L)含有各种水合形式的乙二醛,一些氧化产物，如乙二醛酸、蚁酸及一些能降解RNA的化合物，因此必须去除这些杂质。
（3）乙二醛反应混合物
6 ml DMSO，2 ml 去离子乙二醛，1.2 ml 10 × BPTE 电泳缓冲液，0.2 ml 溴乙锭 （10mg/ml 水溶液），分装成小份，贮存于-70℃。
2）方法
电泳分离RNA：
(1) 配置乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：
RNA（总共 10 μg） 1 ~ 2 μl乙二醛反应混合液 10 μl每个电泳泳道中可分析10μg RNA。用Northern法可分析10μg
总细胞RNA 即可检测到其中的大量mRNA。要检测到稀有RNA则需要至少1.0μg poly（A）+
RNA。RNA相对分子质量标准参照物应当像待侧样品一样的乙二醛反应液中制备。
(2) 盖上离心管的盖子。将RNA 溶液在55℃放置60 min，在冰水中冰浴10 min，然后离心5s，使所有液体沉到离心管底部。
(3) 在样品加热过程中，将琼脂糖凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的1×BPTE电泳缓冲液，使其没过凝胶约1 mmol/L。
