PK-120 cDNA 克隆实验
实验方法原理
实验材料 cDNA
试剂、试剂盒 Ready-To-Go DNA 标记试剂盒人肝脏 λgt11 cDNA 文库人肝脏 λgt10 cDNA 文库杂交溶液SSC 溶液pBluescript II SK 载体
仪器、耗材 PCR 扩增仪
实验步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」
1. 杂交反应
抽提出的 50bp 的 PCR 产物用 PCR II 载体亚克隆，大量制备，用限制性消化酶 EcoRI 将 50bp 的插入片段切下，用 [α-32P] dCTP 标记已克隆的 50bp DNA，并作为探针筛选人肝脏 λgt11 cDNA 文库，获得 11 个阳性克隆，测定最长的阳性克隆 λPK5 序列，这个克隆（1.7kb）编码的 PK-120 的碳末端，为了获得编码 PK-120 其余部分的克隆，用 [32P dCTP] 标记的 λPK5 插入片段作为探针筛选人肝脏 λgt10 cDNA 文库，在杂交液中 60℃ 预杂交， 65℃ 杂交过夜，然后在 60℃ 用 0.1％SDS 的 2×SSC 溶液 30 min 洗 4 次，洗净。将阳性克隆的插入片段进一步亚克隆，插入 Bluescript II SK-vector 载体，获得 106 个阳性克隆，测定阳性克隆 λPK67（3.0kb）序列，λPK67 编码 PK-120 的非 5' 端密码子区域及 PK-120 氮末端，并含有信号肽序列。
2. cDNA 推测 PK-120 一级结构的特征
PK-120 的核苷酸序列据此推导的氨基酸序列见图。 PK-120 的 cDNA。编码区为开放阅读框，有 2790bp，以密码 ATG 为起始，以密码 TAG 为结尾，从而推测出 PK-120 蛋白质氨基酸序列。它含有 28 个氨基酸组成的信号肽，成熟蛋白有 902 个氨基酸组成， 20％ 序列为蛋白质测序所证明。有四个 N-糖基化部位，有三个半胱氨酸残疾，这和 PK-120 的氨基酸组成测定结果一致。 Cys719 和 Cys892 在 35kDa 片段内形成二硫键，Cys186 以游离状态存在。PK 的酶切位点附近的序列是 -Phe-Arg-Xaa-Arg455，Arg633 和 Arg660 是 PK 的切断部分。
据同源性分析表明：PK-120 氨基酸序列和人胰蛋白酶抑制剂 （inter-α-trypsin inhibitor，ITI）超家族的重链
HCs 有关，和 HC1，HC2 分别具有 34％，31％ 的同源性，和人前 α 胰蛋白酶抑制剂 HC3 有 38％
的同源性。已有的研究表明，PK-120 和 ITI 一样，是一种主要急性相蛋白，这为研究炎症产生的复杂过程打开了新的大门。
收起
注意事项
其他
试剂：
Ready－To－Go DNA 标记试剂盒
人肝脏 λgt11 cDNA 文库
人肝脏 λgt10 cDNA 文库
杂交溶液：7％（w/v）聚乙二醇 6000，10％ SDS，100ug/ml 酵母 tRNA
SSC 溶液：15 mmol/L 枸橼酸钠，15 mmol/L NaCl，pH 7.0
pBluescript II SK 载体
