等电聚焦和二维凝胶电泳实验（三）
二、方法
蛋白质样品制备
稳定的样品制备对于任何成功的生物分析性测定都是至关重要的。为了增加实验的重复性, 并将预期外的变异降至最小，使用的缓冲液和材料都应该是质量最好的，并且在采购时需特别小心。应该使用小分子蛋白酶和磷酸酶抑制剂，如抑肽酶 (aprotinin)、亮抑肽酶 (Ieupeptin)、胃蛋白酶抑制剂 (pepstatinA)、木瓜蛋白酶抑制剂 (antipain)、4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟 (AEBSF)、铒酸钠（sodiumorthovanadate)、冈田酸（okadaicacid) 及微囊藻素 (microcystin) 等 (或采用这些小分子抑制剂的商品化试剂盒）。值得注意的是，不要采用会在二维凝胶中溶解的抑制剂 (如大豆胰蛋白酶抑制剂)①。
(1) 只要样品随后会沉淀以移除非蛋白质离子组分 (可严重干扰等电聚焦的成分, 详见本章 3.2 节）, 则基本上可以使用任何一种蛋白质提取缓冲液。随后用一种与二维凝胶相兼容的缓冲液重悬样品。在许多情况下蛋白质提取物无需沉淀，直接在这种缓冲液中制备和分析。不用将额外的离子化合物加入到样品中，下述缓冲液已含有充分的高离液活^性（chaotropicactivity)。
①标准二维凝胶电泳裂解缓冲液 (RabiUoucUl 卯 8):7mol/L 尿素、2mol/L 硫脲、4%CHAPS、2 mg/mLDTT 及 50 mmoVLpH8.0 的 Tris-HCU
②用于膜相关蛋白质时有所调整：7mol/L 尿素、2md/L 硫脲、2% 脒基磺基甜菜喊-14 及 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl。缓冲液系统包含其他盐和去污剂，尤其是十二烷基磺酸钠，可更有效地提取蛋白质，但必须在进行等电聚焦前先沉淀。
③TNE:50 mmol/LpH7.6 的 Tris-HC1、150 mmol/LNaCl、2 mmol/LpH8.0 的 EDTA、2 mmol/LDTT 及 l^WNP-40。
④RIPA 缓冲液：50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl、150 mmol/LNaCl，l%NP-40、0.5% 脱氧胆酸及 0.1%SDS。
(2) 迅速重悬细胞以抑制蛋白酶解活性是至关重要的。将提取物 15000 g 或 100000 g 离心 10 min，除去可干扰等电聚焦的不溶性蛋白质和磷脂。
(3) 某些情况下，超声可断裂核酸使其在随后的净化步骤中与磷脂一同被除去，从而提高样品质量。核酸和磷脂这两种非蛋白质类阴离子组分都会干扰等电聚焦 (详见本章 3.2 节）。建议将样品放置冰上，并使用超声仪尖端探头进行短脉冲处理。
(4) 在所有的步骤中，使体系保持冷环境是很重要的, 尤其是含有尿素的样品绝不能被加热。尿素过热 (超过 37°C) 会加速异氰酸盐 (一种尿素的自然分解产物）的形成，反过来将使自由氨基甲酰化。当该反应发生在蛋白质上时 (发生在氨基末端的残基上或在赖氨酸残基的 e-氨基上），会阻止这些位点的质子化，引起等电点的酸性漂移。二维凝胶电泳中大量样品氨基甲酰化造成的结果是漂亮的蛋白质斑点串，看起来好像是翻译后修饰，但却完全是伪迹。
(5) 测量蛋白质浓度可采用各种标准方法。需注意要采用与蛋白质提取缓冲液相兼容的方法。例如，CHAPS 和硫脲（尽管完全适合于蛋白质提取）将会干扰 Bradford 或 BCA 实验，导致数据错误和不可靠。遇到这些情况时，应该在定量前沉淀分装出来的小份样品，再重溶于适当的缓冲液中，或采用与定量实验相兼容的去污剂。
(6) 对于细胞培养实验，蛋白质浓度可由细胞数目估算得出。例如，对于由 697 前-B 淋巴瘤细胞株制备得到的蛋白质样品（可从德国微生物菌种保藏中心获得，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZNo:ACC12)，IO7 个细胞约对应 Img 蛋白质提取物。为了移除生长培养基组分 (尤其是血清蛋白质），在收集细胞前必须要彻底地清洗细胞 (至少用 PBS 清洗 2 次)。需用细的移液器 tip 头将最终的细胞沉淀中所有的 PBS 小心吸去。细胞沉淀 (通常每管 IO8 个细胞) 保存在一 8 0°C。
(7) 细胞提取物此时可以用于脱水的梯度胶条，可以通过胶内再水化或是杯上样完成。在加人样品前，应该加人适当的两性电解质或是 IPG 缓冲液，大多数只需 0.5%(V/V)(但如果需要的话增量到 2% 也可以接受）。如果样品缓冲液中没有溴酚蓝，加入少量 (可加入干固体的少许晶粒, 或者几微升溴酚蓝水溶液) 以作为等电聚焦的失踪染料，同时也作为杯上样过程中的视觉辅助。或者，样品可无期限地先保存在一 8 0°C。
样品净化与沉淀
正如前述，有时非蛋白质离子 (如盐、磷脂) 的存在会降低 IPG 胶条的电阻, 干扰等电聚焦，因此在不使胶条过热的情况下难以获得需要的高电压以进行高分辨率聚焦。由于大部分商品化的等电聚焦仪器都将许多胶条集合在并联电路上，其中一个胶条出现电阻显著性差异将会对其他胶条分离造成不利影响。
通常一 欠净化或沉淀步骤可以移除这些干扰离子，或者至少使所有样品标准化至具有相似电阻。沉淀不仅可以同时移除多种污染物，而且还能有效瓦解复合物和不可逆地抑制蛋白酶活性。最有效的沉淀方法是使用甲醇和三氯甲烷 [根据 Wessel 和 Flugge(1984)] 或使用三氯乙酸、脱氧胆酸盐和丙酮 [根据 Arnold 和 UlbriCh-H o fmann(1999)]。
在等电聚焦前，蛋白质必须在增溶液中再溶解 (详见本章 3.1 节）。此外，一些用于蛋白质二维凝胶分析的沉淀试剂盒也可从一些商业渠道获得。Wessel 和 Flugge(1984) 方法的改编版描述如下。
(1) 将预定量的蛋白质提取物用水补足体积至 1 00 pL。
(2) 加人 3 0 0 水 (3 倍体积）。
(3) 加人 400 甲醇 (4 倍体积)。
(4) 加人 100fiL 氯仿 (1 倍体积)。
(5) 剧烈涡漩振荡并离心。蛋白质沉淀物将出现在分界面上。
(6) 将水/甲醇混合物从分界面顶端去除，小心不要扰动分界面。沉淀的蛋白质通常不会形成一个可见的白色分界面，因此注意不要破坏分界面。
(7) 再次加人 400 甲醇以清洗沉淀。
(8) 剧烈涡漩振荡并离心。蛋白质沉淀物便沉积于试管底部。
(9) 去除上层清液，并用真空离心机将蛋白质沉淀简单地干燥。
(10) 在适量的可兼容二维凝胶的缓冲液中重悬这些蛋白质沉淀 (详见本章 3.1 节）。
当用沉淀法作为净化步骤时，建议蛋白质起始浓度为 1~1 0 mg/mL。如果蛋白质样本过稀，在清除沉淀后将很难定量地回收蛋白质。冻/融也应控制在最少量，通常 ImL 分装量或更少的冷冻样本就已足够。对于 DIGE 实验而言，沉淀步骤极大地满足了标记样本在不含游离氨且酸碱平衡的二维凝胶电泳样本缓冲液的需求。
使用酸性范围的 IPG 肢进行等电聚焦
大多数商品化的等电聚焦仪器每次电泳时都能够装载至多 12 条独立的 IPG 胶条。
重要的一点是，要将同一次电泳中待测的每根 IPG 胶条都尽可能保持同一水平，因为在大多数配置中，单个的 IPG 胶条会在正电极和负电极之间形成一个并联电路。任何 IPG 胶条若在组分中 (特别是在离子成分方面) 异于其他胶条，便会影响到所有胶条的分辨率，有时这种消极影响是巨大的。因此，强烈建议只同时聚焦同一 PH 梯度的相同长度的 IPG 胶条，所用的样品也要来源于同一实验（如样本类型和组分要尽可能相同)①。
以下方法用于 24 cm,pH4~7 的 IPG 胶条。
(1) 将 IPG 胶条在含有蛋白质总量高达 0.5~2 mg 的二维凝胶样品缓冲液中再水化 (详见本章 3.1 节），对于每根 24 cm 的胶条，需要在再溶胀托盘中将蛋白质样品稀释或重悬至终体积 450uL。用 2~3 mL 的石蜡油覆盖胶条防止尿素结晶。
(2) 加人样品的胶条的再水化过程至少要经过 12 h, 但更建议在室温下进行一夜。一些蛋白质，特别是高分子质量蛋白质需要更长的时间才能在再水化过程中进入胶条内。
(3) 在完全再水化后, 将胶条移人水平电泳系统, 并将此系统的冷却块温度恒定于 20°C。
(4) 将潮湿的吸干纸铺于再水化的 IPG 胶条两端，电极放置到位，并把石蜡油覆盖在胶条之上&。
(5) 表 30.1 为典型的聚焦方案。
